二氧化硫脲(thiourea dioxide),又名甲脒亚磺酸,分子式为NH2NHCSOOH,白色粉末,用作合成纤维助剂[ 1 ]、还原剂,有一定的抗氧化能力[ 2,3,4,5,6 ]。二氧化硫脲加热至100 ℃时,会分解放出二氧化硫,并析出无定形的硫黄而使溶液呈乳白色[ 3, 7 ]。因此,二氧化硫脲有漂白的功能,常用作纤维工业、造纸工业的漂白剂、脱色剂等[ 4, 7, 8 ]。在莲蓉馅料的制作过程中,旧莲子较干,没有涩味,制作出的莲蓉口感比较好。但由于存放时间久,旧莲子会有些自然微黄色,一般要采用多道工序反复过水滚动漂白,费时费力,且需要大型设备。一些不法商贩为了节省时间和场地成本,在加工过程中会使用含二氧化硫脲的漂白剂对原料进行漂白。同时,他们还会向馅料中添加二氧化硫脲来防止其氧化。因此,二氧化硫脲已经被列入卫生部发布的《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单》。
目前,国内外二氧化硫脲的分析方法主要有化学分析法[ 3, 7, 9, 10 ]、分光光度法[ 9, 11, 12 ]、红外光谱法[ 2 ]和液相色谱法[ 4 ]。这些方法主要用于测定化工原料和印染工业还原剂中二氧化硫脲的含量,而对于食品中二氧化硫脲含量的分析研究尚未见报道。本研究建立了固相萃取-液相色谱-串联质谱测定莲蓉馅料中二氧化硫脲的方法。该方法采用BOND ELUT PLEXA柱(60 mg/3 mL)对样品提取溶液进行固相萃取净化,应用亲水作用色谱(HILIC)对二氧化硫脲进行分离,以保留时间和特征碎片离子定性,以色谱峰面积定量。对该方法进行了检出限、定量限、线性范围、回收率和精密度等方法学验证,结果令人满意。
1200型高效液相色谱仪(配在线脱气机和自动进样器,美国Agilent公司); G6410B Triple Quad LC/MS(配有电喷雾(ESI)离子源,美国Agilent公司); KQ3200型超声清洗器(昆山超声仪器有限公司); N-EVAP-45型氮吹仪(美国Organomation公司); 24通道固相萃取装置(美国Supelco公司); A10型超纯水处理器(美国Millipore公司); SHA-B型水浴恒温振荡器和SK-1型快速混匀器(江苏金坛医疗仪器厂); CT14D型台式高速离心机(上海天美生化仪器设备工程有限公司); BOND ELUT PLEXA(60 mg/3 mL)柱(美国Agilent公司)。
乙腈(色谱纯,德国Merck公司);乙酸乙酯、正己烷(色谱纯,天津化学试剂研究所);异丁醇(色谱纯,天津市光大精细化工研究所)。以下试剂均为分析纯:二氧化硫脲(含量为98.0% )、醋酸铵(含量≥98% )、醋酸(含量≥99.5% )、石油醚(30～60 ℃),国药集团化学试剂有限公司;正丁醇(衡阳市有机化学试剂厂);实验室用水为超纯水。
准确称取二氧化硫脲10 mg于100 mL容量瓶中,加0.05%(如无特殊说明均为体积分数)醋酸溶液溶解后,定容至刻度,配制成100 mg/L 的标准储备液,于4 ℃冷藏保存。使用前根据测定要求采用空白基质样品溶液稀释成相应质量浓度的基质标准工作液。
取1.0 g样品于10 mL离心管中,加入3 mL 0.05%醋酸涡旋混匀(对于含油脂样品，再加入3 mL石油醚涡旋萃取2 min, 10000 r/min 离心2 min,弃去石油醚层后),冰水浴超声提取10 min, 10000 r/min 离心2 min,上清液待净化用。
依次用3 mL甲醇和3 mL水以1.0 mL/min 的流速过柱活化,转移2 mL上清液至固相萃取柱中,自然流出,收集滤液,滤液供液相色谱-质谱测定。
色谱柱为Agilent HILIC色谱柱(100 mm×2.1 mm, 3.5 μ m);柱温为30 ℃;流速为0.4 mL/min;流动相A为0.01 mol/L 醋酸铵(冰醋酸调pH至3.5), B为乙腈。线性梯度洗脱程序:0～7 min, 7%A; 7～9 min,由7%A线性升至15%A; 9～11 min, 15%A; 11～11.01 min,由15%A线性降至7%A。进样量1.0 μ L。
离子源:电喷雾离子源(ESI),正、负离子模式;扫描方式:多反应监测模式(MRM);加热毛细管电压:4 000 V;雾化器(N2)压力:2.8×105 Pa;干燥气体(N2)温度:350 ℃;干燥气体(N2)流速:9 L/min。
分别以水、0.05%醋酸、0.1%醋酸和0.2%醋酸为提取溶液，考察了提取溶液pH值对固相萃取回收率的影响。结果显示:随着pH值的降低,回收率也降低,但不明显。pH值高时峰面积及峰高较高,可能是由于pH值低时会抑制电离，但目标化合物在酸性环境下较稳定。综合考虑最终采用0.05%醋酸作为提取溶液。进一步比较了0.05%醋酸溶液直接提取目标化合物后过固相萃取柱和先用水提取目标化合物、正丁醇萃取、浓缩后用0.05%醋酸溶液溶解再过固相萃取柱两种前处理方式,结果发现前者回收率明显高于后者。这主要是因为正丁醇浓缩耗费时间较长,且氮吹时需要较高温度。在此温度下,二氧化硫脲较长时间浓缩损失严重,直接测定其浓缩液,目标化合物几乎无响应。因此选用0.05%醋酸溶液直接提取目标化合物后过固相萃取柱作为样品前处理方法。
考察了不同类型的固相萃取柱对目标化合物的净化效果，包括强阳离子交换色谱(SCX)柱(60 mg/3 mL)、氨基柱(500 mg/6 mL)、C18柱(500 mg/6 mL)和BOND ELUT PLEXA柱(60 mg/3 mL)。使用SCX柱净化过程中需用碱性有机试剂洗脱,目标化合物容易分解[ 4 ];而使用氨基柱时发现洗脱时乳化现象严重,且回收率低;使用C18柱时因为其柱填料量大,回收率也较低;使用BOND ELUT PLEXA柱净化时回收率较高,净化效果较好。因此,最终选择BOND ELUT PLEXA固相萃取柱对样品进行净化。
考察了Agilent SB-C18 (150 mm×2.1 mm, 5 μ m)、Agilent SCX (150 mm×2.1 mm, 5 μ m)和Agilent HILIC (100 mm×2.1 mm, 3 μ m) 3种色谱柱对目标化合物的分离。结果发现,二氧化硫脲由于极性大,在C18色谱柱上基本没有保留;尽管其含有氨基( - NH2),但在SCX柱上的保留仍然较弱,岀峰时间较快,因此SCX柱不适合选作分离柱。只有在HILIC色谱柱上保留值较合适,因此,最终选择Agilent HILIC(100 mm×2.1 mm, 3 μ m)作为分离时的色谱柱。
考察了乙腈-水、乙腈-0.01 mol/L 醋酸铵、乙腈-0.01 mol/L 醋酸铵(用醋酸调pH至5.0)和乙腈-0.01 mol/L 醋酸铵(用醋酸调pH至3.5) 4种流动相对目标化合物的洗脱效果。结果发现:采用乙腈-水洗脱时,目标化合物峰严重拖尾,且响应值低;加入0.01 mol/L 醋酸铵后峰形明显改善,且目标化合物的保留值和响应值均随着pH值的降低而增大。因此,最终采用乙腈-0.01 mol/L 醋酸铵(pH 3.5)作为流动相。
考察了进样量分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μ L时对色谱峰形的影响。结果表明:峰形随着进样量的增大而变差。当进样量为0.5 μ L和1.0 μ L时,峰形尖锐且对称；2.0 μ L时色谱峰开始展宽；5.0 μ L时出现肩峰；10.0 μ L时有肩峰且前伸严重。综合考虑目标化合物的峰形和响应值,最终选择进样量为1.0 μ L。
二氧化硫脲同时含有氨基( - NH2)和亚磺酸根( - SOOH),因此在流动注射条件下,对1 mg/L 的二氧化硫脲标准溶液分别进行正离子(positive)和负离子(negative)模式的扫描,并对毛细管加热电压(fragmentor)和碰撞能量(collision energy)进行优化，如表1所示。根据欧盟 2002/65/EC指令的规定,禁用药物的质谱确证方法至少需要4个确证点[ 13 ],而负离子模式下二氧化硫脲只有1个子离子。因此选择正离子模式中目标化合物丰度较高、干扰较小的子离子[HCSO]+ (m/z 61)和[H2NCNH] +(m/z 43)进行多反应监测,以m/z 43为定量离子。
按照优化的LC-MS/MS条件测定样品和标准工作溶液,响应值均应在仪器方法的线性范围内,以保留时间(偏差±2.5% )定性,色谱峰面积外标法定量。样品与标准工作溶液的多反应监测色谱图中相同保留时间有色谱峰出现时,用正离子模式扫描(离子对选择m/z 109＞61和m/z 109＞43),并辅以负离子模式扫描(离子对选择m/z 107＞65)。根据样品产生的两组离子对之间的丰度比,参照标准溶液目标化合物的丰度比进行确证(相对丰度分别为≤10% 、10% ～20% 、20% ～50% 、＞50%时,允许的偏差为50% 、30% 、25% 、20% )[ 14 ]。正离子和负离子扫描模式下加标样品溶液的多反应监测色谱图见图1。
为了更好地扣除基质效应,本实验采用空白样品加标溶液制作标准曲线进行定量[ 15 ]。将二氧化硫脲标准储备溶液用空白基质溶液稀释成10、30、50、100、300、500、1000 μ g/L 的系列标准工作溶液,按1.4节条件由低浓度到高浓度依次上机测定,以质量浓度X( μ g/L)为横坐标,峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线。结果显示,二氧化硫脲在10～1000 μ g/L 范围内线性良好,线性方程为Y=5.76×102X-4.41×103,线性相关系数(r2)为0.991。按1.3节前处理方法测定10 μ g/L 空白加标溶液,由仪器软件计算色谱峰信噪比为11.3,以3倍信噪比(S/N)确定方法的检出限为8.0 μ g/kg,低于目前文献[ 2, 3, 4, 7, 9, 10, 11, 12 ]报道的方法,以10倍S/N确定方法的定量限为30.0 μ g/kg。
采用标准加入法测定方法回收率,取空白珍品白莲蓉馅料、鲍鱼莲蓉馅料和燕窝莲蓉馅料混合样品基质18份,分别添加3个水平的标准溶液,每个加标水平进行6次重复试验。由表2可知,样品加标回收率为75.3% ～80.7% , RSD不大于4.83% ,均满足实际样品测定的要求[ 16 ]。
应用本文建立的方法对12个馅料样品进行了测定,均未检出二氧化硫脲(含量均低于8.0 μ g/kg)。
本文建立了一种固相萃取-液相色谱-串联质谱测定莲蓉馅料中二氧化硫脲的方法。通过对样品预处理方法和液相色谱-质联用分析条件的选择及优化,可以在10～1000 μ g/L 范围内对馅料中的二氧化硫脲进行定性定量分析,检出限低于目前文献所报道的方法,回收率和精密度均满足实际样品测定的要求。本方法可为馅料行业的原料把关、加工、储存以及运输过程中的质量监控提供技术支撑。
2014, Vol. 32 Issue (1): 21-25
PDF (849KB)
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