标记定量方法是基于在肽段中引入稳定同位素标记(如 ²H、¹³C、¹⁵N、¹⁸O),使得在同一次质谱扫描中标记“轻”和“重”同位素的多肽具有相同的色谱行为和离子化效率,此时成对出现的质谱峰信号的相对强度可以精确地反映样品中多肽的丰度比例(蛋白质的比例)。因此该方法具有良好的定量可靠性,不仅可以用于不同样品间的相对定量分析,还可以用于蛋白质的绝对定量分析。

根据稳定同位素掺入的方式,标记方法可以分为代谢标记、酶促标记和化学标记等。经典的体内代谢标记包括 ¹⁵N体内代谢标记^{[ 3 ]}、SILAC^{[ 4 ]}等。在此基础之上对SILAC技术进行扩展,发展了一系列新的方法,如culture-derived isotope tags(CDITs)^{[ 5 ]}和SILAC双重(使用两种不同的“重”氨基酸)标记^{[ 6 ]}等。近年来,随着MRM的广泛应用,对于大批量内标的需求催生了基于SILAC策略进行重组表达串联体蛋白质(QconCAT, contamers of Q peptides)技术，以规模化制备内标肽段^{[ 7 ]}。利用该技术可以将来源于不同蛋白质的特异肽段整合在一个QconCAT蛋白质中。通过在蛋白质重组表达时加入重标氨基酸的方法,得到大量蛋白质的内标肽段,避免了传统的化学合成肽段费时、费力的问题,有利于对目标蛋白质进行相对或绝对的定量分析^{[ 8 ]}。

2001年,Fenselau实验室^{[ 9 ]}首先将¹⁸O酶切标记的方法用于蛋白质组相对定量的研究。随后,人们不断对此方法进行改进,重点解决其标记效率、标记稳定性和回交等问题。Zhao等^{[ 10 ]}使用酶促进剂Rapigest^TM SF改善肽段的分散度,使用微波加热提高反应效率,使标准肽段的 ¹⁸O标记效率高达100% ;再使用高浓度还原剂和烷基化试剂对胰酶彻底灭活,抑制了 ¹⁸O-¹⁶O回交反应,标记肽段6天内稳定。现在,固定化酶技术的发展大大提高了¹⁸ O酶切标记的效率和稳定性,利于该标记定量方法的进一步广泛应用。

在标记方法中,化学标记的种类最为繁多,应用也最为广泛。依据标记标签的不同,化学标记可以分为同位素标记和等量异序标签标记。代表性的化学标记方法包括标记多肽(蛋白质)N端氨基的iTRAQ^{[ 11 ]}、标记肽段C端羧基(-COOH)的酯化标记、针对半胱氨酸巯基(-SH)的ICAT^{[ 12 ]}、以及与质谱多反应监测(MRM-MS)技术联用的mTRAQ标记技术^{[ 13 ]}等。化学标记定量技术发展的一个重要方向是多重定量标记,如iTRAQ最大的特点就是可以进行八重定量标记,从而大大提高了分析效率。最新的串联质谱标签(tandem mass tag, TMT)最多可以实现十八重标记,再加上高分辨质谱仪的使用^{[ 14 ]},规模化精确定量多种细胞状态下相同蛋白质的表达变化已经变为现实。

金属元素化学标记蛋白质组定量也是近年来发展的一类新方法,也拓展了蛋白质组定量的新思路。与稳定同位素标记方法相比,金属元素标记方法具有试剂价廉易得^{[ 15 ]}、可发展成多重标记技术、可与生物质谱和元素有机质谱联用、可用于蛋白质组相对和绝对定量的双重优势^{[ 16 ]}等特点。

相对于传统的标记定量方法,非标记定量方法不需要在样本分析前对蛋白质/多肽进行标记,避免了样本标记处理环节造成的可能的样品损失,在检测肽段的数量、蛋白质的覆盖率和分析通量方面具有较大优势,且不受样品来源和数量的限制,因而近年来得以迅速发展^{[ 17, 18, 19, 20 ]}。

传统的非标记定量方法包括准确质量结合色谱保留时间标签法(accurate mass and retention time tag method, AMT)^{[ 21, 22 ]}、Decyder-MS^{[ 23, 24 ]}和基于质谱归一化的非标记定量方法。基于质谱的归一化定量方法的理论基础是多肽的丰度与其在质谱中被检测到的次数或者质谱峰强度具有一定的相关性。如蛋白质丰度指数方法(protein abundance index, PAI)^{[ 25 ]}、多肽匹配数(peptide hits)^{[ 26 ]}、谱图计数(spectral count)^{[ 27, 28 ]}、多肽离子强度计数(peptide ion intensity counting)^{[ 29, 30 ]}等。在此基础之上又发展了综合多肽计数(peptide counting)、谱图计数(spectral count)和碎片离子峰强度(fragment-ion intensity)等3种信息的归一化非标记定量方法SIN(normalized spectral index)^{[ 31 ]}以及将谱图计数的非标记定量方法与SILAC定量方法整合的SILAC多肽计数比例分析(SILAC peptide count ratio analysis, SPeCtRA)定量方法^{[ 32 ]}等。这些方法均具有较好的准确性和灵敏度,能应用于复杂生物样品的高通量蛋白质组定量分析。

近年来,Aebersold等^{[ 33, 34 ]}发展了将MRM绝对定量和非标记定量相结合进行高通量蛋白质组定量分析的策略,采用了基于每个蛋白质中信号最强肽段(“best-flyer” peptides)信号强度的定量策略(Top3),取得了很好的定量结果。Schwanhusser等^{[ 35 ]}将基于iBAQ(intensity based absolute quantification)的定量方法与多肽计数、PAI、intensities、Top3等定量方法进行了详细的比较研究,发现iBAQ定量方法具有更好的准确性。若结合样本的上样量,可以实现对大批量蛋白质的准确绝对定量分析^{[ 36 ]},其定量效果甚至可以与MRM绝对定量结果相媲美,突破了传统非标记定量方法一般用于相对定量分析的局限,扩展了非标记定量方法的应用范围。

鉴于非标记定量技术对LC-MS/MS分析平台的稳定性、样本处理的重现性、数据处理软件以及海量数据处理方法的可靠性等都有极高的要求,因此需要对上述条件进行严格系统的质控,才能保证定量结果的准确性。

总之,蛋白质组学研究已经从单纯提高覆盖率的定性研究向更加真实地描述生物体本质的定量研究发展。尽管蛋白质组学定量方法已经取得了显著的进展,但距离真正准确和方便地描述细胞和生物体内蛋白质组的丰度及其表达量的变化还有距离,在定量标记的分析效率、分析通量和准确性上仍存在较大的提升空间,非标记定量方法的准确性特别是数据处理软件等均成为今后的重点发展方向。
致谢 感谢卫军营博士在文献收集和文章撰写中提供的帮助。