氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate, EC)是在食品发酵过程中产生的一种化学污染物,国际癌症研究机构(IARC)认为EC为人类2A类致癌物[ 1 ]。在众多的发酵食品中,发酵酒由于EC前体物(尿素、瓜氨酸和氰化物等)的存在而受到关注。加拿大规定了葡萄酒等酒精饮料中EC的限量(30 μ g/L),美国规定佐餐葡萄酒(酒精度≤14% ,v/v,下同)中EC含量不得超过15 μ g/L[ 1 ]。我国是白酒生产和消费大国,黄酒是我国传统的酒类产品。2012年媒体报道了我国某知名品牌的黄酒中检出EC后,引起了黄酒行业的高度关注,而白酒中EC的污染也不容忽视。灵敏、可靠、快速的分析技术亟待建立。
目前,饮料酒中EC的常用检测方法主要有气相色谱-质谱(GC-MS)法[ 2, 3, 4, 5, 6 ]和高效液相色谱-荧光(HPLC-FLD)法[ 7, 8, 9, 10, 11 ]。其中GC-MS灵敏度较高,但样品前处理过程复杂,需进行如液液萃取、固相萃取、顶空-固相微萃取等;这些前处理方法耗时费力,需要使用大量有机试剂,可能对环境和操作者的身体健康造成不良影响。目前采用HPLC-FLD法测定白酒中EC含量的相关报道极少,且或不考虑酒精度的影响[ 10 ],或需对待测样品的酒精度进行调整[ 9 ]。钟其顶等[ 11 ]使用HPLC-FLD法测定黄酒中的EC含量,不需要复杂的前处理过程,可直接对黄酒样品进行衍生后测定,简单快速,适合大批量黄酒样品的快速检测。但该方法的不足是:酒类样品的酒精度对EC含量的检测会产生一定的影响[ 9 ],即同一含量EC的峰面积在不同酒精度下存在差异,这就要求测定前对待测样品的酒精度进行适当调整。黄酒和葡萄酒的酒精度大约为15%左右,测定这类样品时,一般将标准曲线的酒精度调节为15% 。试验结果显示在此酒精度下,可进行黄酒和葡萄酒中EC含量的测定[ 10, 11 ]。但是,对于白酒来说,情况复杂得多。白酒的品种和类型多,且酒精度相差明显,市售白酒的酒精度在30% ～70%范围内,很难用一个固定酒精度下的标准曲线准确测定不同酒精度白酒的EC含量,为此,有必要建立适合白酒中EC含量测定的检测方法。曾有文献[ 12 ]比较了HPLC-FLD和GC-MS两种方法测定白兰地中的EC含量,结果显示两种方法所测得的EC含量值存在一定差异且不稳定,这种现象的出现很可能是白兰地中的酒精度与标准曲线酒精度的差异影响了HPLC-FLD法的准确测定。
本研究拟在用HPLC-FLD法测定黄酒、葡萄酒EC含量的基础上,通过比较不同酒精度下EC含量(峰面积)的相关性,建立不同酒精度间EC含量的相对校正系数及不同酒精度下白酒中EC含量的测定方法。
高效液相色谱仪(LC-20AD,日本岛津公司)、气相色谱-质谱联用仪(7890A GC-5975C MS,美国安捷伦公司)、固相萃取装置(美国Supelco公司)、氮吹仪(美国Organomation公司)、涡旋混合器(美国Scientific Industries公司)。
乙酸钠(CH3COONa·3H2O)、浓盐酸、正丙醇、无水乙醇为分析纯,正己烷、乙酸乙酯、乙醚、乙腈和甲醇为色谱纯(Fisher Scientific公司),冰乙酸为HPLC级(TEDIA试剂公司),硅藻土Extrelut TM 20(Merck公司)。9-羟基吨,纯度＞98%(Alta Aesar公司);氨基甲酸乙酯标准品,纯度＞99%(Dr. Ehrenstorfer公司),氨基甲酸乙酯-d5(Cambridge Isotope Laboratories公司)。实验用水为双蒸水。白酒购于北京市各大超市。
9-羟基吨溶液:准确称取9-羟基吨粉末 0.1980 g,加正丙醇溶解至50 mL,浓度为0.02 mol/L。避光放置,4 ℃贮存。
氨基甲酸乙酯标准储备液:准确称取氨基甲酸乙酯标准品 0.0100 g,加无水乙醇溶解至10 mL,质量浓度为 1000 mg/L, -18 ℃贮存。氨基甲酸乙酯标准工作液:用水逐级稀释储备液,使其质量浓度为5 mg/L, 4 ℃贮存。
精确量取样品1.0 mL,加9-羟基吨溶液600 μ L和1.5 mol/L 盐酸溶液100 μ L,混匀,置于暗处衍生30 min后,经有机微孔滤膜过滤,待分析。
Agilent TC-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μ m)。流动相A为水,含0.02 mol/L 乙酸钠;B为乙腈。梯度洗脱程序:0～5 min, 30%B～50%B; 5～25 min, 50%B～75%B; 25～26 min, 75%B～90%B; 26～29 min, 90%B; 29～30 min, 90%B～30%B; 30～35 min, 30%B。进样量：40 μ L;流速：0.8 mL/min;柱温：30 ℃;激发波长：233 nm,发射波长：600 nm。
在EC阳性白酒样品(EC含量15.8 μ g/L )中添加200 μ g/L 的EC,按1.3节方法衍生后进样,确定衍生产物的保留时间,进行定性鉴别。参考文献[ 11, 12 ]中的色谱梯度洗脱程序,确定1.4节中的色谱梯度洗脱条件。图1为EC阳性白酒样品及其加标样品的色谱图。
配制EC质量浓度分别为25、50和100 μ g/L 的高、中、低3种水平的标准溶液,每个浓度水平分别用无水乙醇和水调配成酒精度为5% 、15% 、25% 、35% 、45% 、55% 、65% 、75%及85%的9份标准溶液,按1.3节方法处理并进样分析。分别以酒精度(%)与EC峰面积为横坐标和纵坐标,绘制高中低3种浓度水平的曲线图(图2a～c)。
由图2a～c可知,在同一浓度的EC标准溶液中,不同的酒精度对EC的峰面积有较大的影响,且3种浓度水平的EC峰面积随酒精度的变化趋势基本相同。此现象发生的原因被认为是酒精度影响了EC与9-羟基吨发生的衍生反应(亲核取代反应)[ 9 ]。另外,从EC峰面积与酒精度的线性关系图(图2d～f)可以看出,在5% ～65%的酒精度范围内,EC峰面积与酒精度的线性关系良好,其相关系数R2大于0.984。鉴于此,同一EC浓度下,不同酒精度间的EC峰面积存在一个相对校正系数F,即已知一种酒精度下的EC峰面积,可通过相对校正系数进行换算,获得另一种酒精度下同一EC浓度的不同峰面积。
进一步考察了在5% ～65%范围内,酒精度与EC含量峰面积呈线性相关的稳定性以及不同酒精度间相对校正系数F的一致性和准确性。在25、50和100 μ g/L 3个EC质量浓度水平下,绘制在5% ～65%的酒精度范围内的线性回归曲线,每个浓度水平重复测试3次,结果显示9次试验的线性相关系数均大于0.98。同时计算不同酒精度与45%酒精度之间的相对校正系数F,以9次试验间的相对标准偏差(RSD)来确定F值的一致性和准确性。结果如表1所示：每个酒精度与45%酒精度间的F值的相对标准偏差均小于3% ；且酒精度越接近于45%,相对标准偏差越低,精密度越好。
首先,根据待测白酒样品的酒精度分布,选择一个适当酒精度(如45%),配制系列EC标准溶液,制备标准曲线。其次，采用HPLC-FLD法测定白酒样品中EC含量的峰面积,根据待测白酒样品的酒精度,通过相对校正系数F(如与45%酒精度的相对系数,可参考表1中的F值)换算成EC标准溶液所对应酒精度下的峰面积。最后将换算得到的EC峰面积依据标准曲线,用外标法计算白酒样品中的EC含量。
配制45%酒精度下的系列EC标准溶液,质量浓度范围在10～500 μ g/L 之间。移取系列标准溶液各1.0 mL,按照1.3节方法进行衍生。对衍生后的系列标准溶液进行检测,得到各溶液中EC的峰面积。以系列标准溶液质量浓度( μ g/L )为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。结果显示二者在10～500 μ g/L 范围内呈线性关系,方程为y=4029.6x-3197.4,相关系数R2为 0.9999。当样品中EC的添加浓度为10 μ g/L 时,信噪比大于10,因此,确定本方法的定量限为10 μ g/L。
用两种不同酒精度(38%和52% )的白酒样品进行回收率实验。在50～400 μ g/L 范围内分别添加3种不同浓度的EC标准溶液后,摇匀,放置2 h,然后按照1.3节方法进行衍生。用HPLC-FLD方法测定峰面积,按照2.3节方案,计算出EC的含量。每个浓度水平重复6次,其回收率和相对标准偏差结果见表2,回收率在98.9% ～108.2%之间,相对标准偏差在0.6% ～4.9%之间。
取相同加标样品溶液,分别放置1、2、4、8、12 h后进行EC衍生反应,测定产物峰面积。结果显示相对标准偏差为1.0% ,表明试样在12 h内稳定。
取5种不同酒精度的白酒样品,分别用HPLC-FLD方法和GC-MS方法[ 5 ]进行测定,结果见表3。两种方法所测定的EC含量值无明显差异,相对平均偏差均在5%以内,表明该方法检测白酒中的EC含量所得到的结果具有良好的可靠性。
对市售不同酒精度的白酒进行测定,结果见表4。在所测定的47种白酒中,EC含量不高于392.2 μ g/L,平均值为63.0 μ g/L,中位数为37.4 μ g/L,第95百分位数(P95)为191.9 μ g/L,检出率为91.5% 。其中,19.1%的白酒中EC含量超过100 μ g/L。本实验所调查的白酒EC含量分析结果与2010年杭州市售白酒的EC含量调查分析结果[ 4 ]基本相符。目前,一些国外的蒸馏酒中EC含量范围为0.01～6.2 mg/L,其范围跨度较大,主要原因是国外的水果白兰地中EC含量较高[ 1, 13, 14 ]。
据联合国粮食和农业组织/世界卫生组织(FAO/WHO)食品添加剂联合专家委员会(JECFA)评估,EC的基准剂量下限(BMDL)为每天0.3 mg/kg bw,单独来源于食品的EC平均暴露量为每天15.0 ng/kg bw,而来自食品和酒精饮料的暴露量为每天80.0 ng/kg bw[ 1 ]。目前,在酒精饮料中,EC的平均含量多是黄酒最高,白酒次之,而葡萄酒和啤酒相对较低。根据此次的市售白酒EC含量的 测定结果,白酒间EC含量的差异较大,EC含量超 过100 μ g/L 的样品量占了总样品量的19.1% 。因此,对白酒中EC含量监测至关重要,且很有必要对白酒进行EC的风险评估。
本研究通过考察酒精度对HPLC-FLD法测定EC含量峰面积的影响,发现二者的相关性,以相对系数校正,建立了HPLC-FLD法快速准确测定白酒中EC含量的方法。解决了酒精度影响HPLC-FLD法测定EC含量的问题,为批量白酒样品中EC的测定提供了简单、快速、准确的方法。
2013, Vol. 31 Issue (12): 1206-1210
PDF (865KB)
2013, Vol. 31 Issue (12): 1206-1210
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