使用超纯水对葡萄酒样品分别稀释50倍、100倍,过0.22 μ m尼龙滤膜,移至样品瓶中,供LC-IRMS测定乙醇和甘油的 δ ¹³ C值。

将250 mL葡萄酒移入蒸馏烧瓶中,使用配有旋转杆和Cadiot柱的冷凝装置,收集78.0～78.2 ℃馏分20～25 mL,把乙醇从葡萄酒中提取出来。利用卡尔-费休法测定馏分中的水含量,计算酒精度,使蒸馏效率在90%以上,蒸馏液的乙醇含量达到85%以上,确保蒸馏过程无同位素分馏,检测结果真实、准确。

样品溶液在流动相的作用下通过色谱柱对样品中的乙醇和甘油进行分离,从色谱柱分离出来的液体经过两个三通阀与0.2 mol/L 磷酸溶液和0.2 mol/L 过二硫酸钠溶液混合,混合后的溶液进入氧化反应器,在反应器中将乙醇和甘油氧化成CO₂和H₂O,经过水气分离单元将CO₂和H₂O分离,水流入废液瓶,CO₂进入质谱进行分析。以上步骤由仪器软件程序自动控制。

色谱柱为Phenomenex Rezex ROA-Organic Acid(H⁺)(300 mm×7.8 mm),流动相为5 mmol/L 硫酸溶液,流速为0.4 mL/min。磷酸溶液和过二硫酸钠溶液的浓度均为0.2 mol/L,在流速为0.04 mL/min 条件下,产生适量的氧气,其信号强度在8～10 V之间。在流动相与化学氧化剂的容器瓶内始终保持氦气流,防止受来自大气中CO₂的污染。氦气的载气压力为1.5×10⁵ Pa。Isolink接口内吹扫气压力为1.4×10⁵ Pa。CO₂标准气压力为1.2×10⁵ Pa,信号强度在6 V左右。氧化反应器温度为99.9 ℃。色谱柱柱箱温度为75 ℃。样品溶液进样体积为10 μ L。

离子源:电子轰击离子源(EI源);扫描方式:正离子扫描;辅助气压力:4×10⁵ Pa;轰击能量:120.8 eV;离子源电压:2.97 kV;真空度:2.0×10^-4 Pa。在每次测定样品前测定3次CO₂标准参考气(每次20 s)。使用Thermo Electron Isodat Version 3.0软件进行数据处理和计算 δ ¹³ C。

由于IAEA-CH6是限制购买产品,因此使用IAEA-CH6碳稳定同位素参考标准对实验室工作标准(葡萄糖水合物, δ ¹³ C值:-26.03‰±0.2‰)进行校准测定,再使用实验室工作标准对CO₂气体进行标定,每次测定样品使用CO₂标准参考气体计算 δ ¹³ C值。在每次样品测定时,至少测定1次实验室工作标准。

根据液相色谱-同位素比质谱技术的应用报道,以水溶性、反相、离子交换、体积排阻的苯乙烯-二乙烯基苯聚合物色谱柱装载阳离子(Ca²⁺、Pb²⁺、Na⁺或H⁺),使用超纯水作为流动相测定水溶性被测物是较好的选择^{[ 15 ]}。据此,比较了Phenomenex Rezex RCM (Ca²⁺)(300 mm×8 mm)和Phenomenex Rezex ROA-Organic Acid (H⁺)(300 mm×7.8 mm)两种色谱柱分离甘油和乙醇的效果。采用Phenomenex Rezex RCM(Ca²⁺)色谱柱对葡萄酒样品进行测定时,甘油和乙醇两种被测物不能分离(见图1a)。当使用Phenomenex Rezex ROA-Organic Acid(H⁺)色谱柱测定葡萄酒中甘油和乙醇时,二者得到很好的分离(见图1b)。因此,本方法选用Phenomenex Rezex ROA-Organic Acid(H⁺)色谱柱分离葡萄酒中的甘油和乙醇。

图1

Fig. 1

图 1 葡萄酒样品中甘油和乙醇在不同色谱柱上的分离效果 Fig. 1 Separation of glycerol and ethanol in wine on different columns a. Phenomenex Rezex RCM (Ca2+) column (300 mm×8 mm); b. Phenomenex Rezex ROA-Organic Acid (H+) column (300 mm×7.8 mm). LC conditions: mobile phase, 5 mmol/L sulfuric acid; flow rate, 0.4 mL/min; temperature, 75 ℃.

实验发现,当柱温较低(30 ℃)时,甘油与乙醇能获得较好的分离效果,但被测组分氧化不完全。当柱温为75 ℃时,被测组分完全氧化,且甘油和乙醇分离效果良好(见图1b),测定结果重复性好,因此选择色谱柱温度为75 ℃。

使用5 mmol/L 硫酸溶液作为流动相,葡萄酒样品中的甘油、乙醇和基质中的糖分能得到较好的分离,满足检测需要。而当硫酸溶液浓度增加至25 mmol/L 时,被测物与样品基质分离效果无明显改善,因此使用5 mmol/L 硫酸溶液作为流动相。在该浓度条件下,流动相流速一般选择为0.3～0.5 mL/min。通过多次检测葡萄酒样品,发现流速对乙醇的出峰时间、色谱分离以及峰形影响不明显,而对甘油的影响较为明显,当流速为0.4 mL/min 时,甘油检测的重复性和再现性均为最佳。因此,本方法采用0.4 mL/min 作为流动相流速。

综上所述,本方法选择流动相为5 mmol/L 硫酸溶液,流速为0.4 mL/min,柱箱温度为75 ℃。在该条件下,葡萄酒样品中甘油和乙醇获得较好的分离效果(见图1b)。