高效液相色谱法同时测定尿液中4种非蛋白氮的含量


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	马玉花

	黄冬群

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	封顺

马玉花¹, 黄冬群¹, 张瑞¹, 徐世茹², 封顺¹

1. 新疆大学石油天然气精细化工教育部自治区重点实验室, 新疆乌鲁木齐 830046;
2. 新疆维吾尔自治区人民医院肾病科, 新疆乌鲁木齐 830001

收稿日期：2013-07-22

基金项目：国家自然科学基金项目(21075105);新疆维吾尔自治区教育厅重点项目(XJEDU2010I03).

通讯作者：封顺,Tel(0991)8528087,Email:fengshun@xju.edu.cn

摘要：建立了高效液相色谱(HPLC)同时测定尿液中4种常见的非蛋白氮物质——肌酸(Cr)、尿肌酐(Cn)、尿酸(Ua)及假尿嘧啶核苷(Pu)含量的方法。尿液首先经丙酮沉淀法除去大分子化合物,然后冷冻干燥,复溶后直接进行HPLC分析。色谱分离选用Waters RP18 Column (150 mm×4.60 mm,3.5 μm),以10.0 mmol/L磷酸缓冲溶液 (pH 4.78)和乙腈为流动相进行梯度洗脱,流速为0.8 mL/min,于220 nm波长下检测,可在7 min内完成4种非蛋白氮的快速分离分析。结果表明Cr、Cn、Ua、Pu在0.1~250 mg/L范围内线性关系均良好(相关系数均大于0.999),检出限分别为9.31、26.19、4.70、6.30 μg/L,加标回收率为81%~111%,峰高的相对标准偏差(RSD, n=3)为0.23%~2.78%,满足定量要求。该法简便、快速,结果准确可靠,为2型糖尿病(T2DM)患者肾功能损坏的研究提供了检测手段。

关键词：高效液相色谱法肌酸尿肌酐尿酸假尿嘧啶核苷尿液

Simultaneous determination of four common nonprotein nitrogen substances in urine by high performance liquid chromatography

MA Yuhua¹, HUANG Dongqun¹, ZHANG Rui¹, XU Shiru², FENG Shun¹

1. Key Laboratory of Oil & Gas Fine Chemicals, Ministry of Education, Xinjiang University, Urumqi 830046, China;
2. Department of Nephrology, Xinjiang Uygur Autonomous Region People's Hospital, Urumqi 830001, China

Received: 2013-07-22

Abstract: A high performance liquid chromatographic (HPLC) method was proposed to simultaneously determine four common nonprotein nitrogen substances, including creatine (Cr), creatinine (Cn), uric acid (Ua) and pseudouridine (Pu) in urine. After proteins being removed by acetone precipitation method, freeze drying and redissolving, the urine samples were analyzed by HPLC. Chromatographic separation was performed on a Waters RP18 Column (150 mm×4.60 mm, 3.5 μm) in gradient elution mode using 10.0 mmol/L KH₂PO₄ solution (pH 4.78) and acetonitrile as mobile phases at a flow rate of 0.8 mL/min. The samples were detected at 220 nm. Rapid separation was achieved within 7 min. Under the optimized conditions, good linearities of four common nonprotein nitrogen substances were obtained in the range of 0.1-250 mg/L. The detection limits were 9.31 (Cr), 26.19 (Cn), 4.70 (Ua), and 6.30 (Pu) μg/L and the recoveries were in the range of 81%-111% with the relative standard deviations of 0.23%-2.78% (n=3). The results demonstrate that this method is simple, rapid and accurate with good reproducibility, and can provide early diagnosis and preliminary judgment for type 2 diabetes mellitus (T2DM) patients with renal damage.

Key words: high performance liquid chromatography (HPLC) creatine creatinine uric acid pseudouridine urine

糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病(diabetes mellitus, DM)最常见的并发症^{[ 1, 2 ]},也是DM患者的主要死亡原因之一^{[ 3 ]}。由于临床上现有的DN检测方法对肾脏的早期轻度损伤检出性不佳,导致病人在被确诊为DN时,往往肾脏损伤已比较严重、无法逆转,进而向肾衰和尿毒症发展,最终导致死亡^{[ 4 ]}。因此,及时、有效地对DM患者肾脏的早期轻度损害进行检测和诊断就显得极为重要,寻找DN早期监测指标物是目前面临的重要研究课题^{[ 5, 6 ]}。

文献报道非蛋白氮代谢产物肌酸(creatine, Cr)、肌酐(creatinine, Cn)、尿酸(uric acid, Ua)及假尿嘧啶核苷(pseudouridine, Pu)等化合物的含量与肾功能情况直接相关。Cn因不被肾小球重吸收而成为使用最广泛的监测肾功能的指标^{[ 2, 7 ]}。Ua大部分从肾脏排泄,也能反映肾功能的健康状况^{[ 8 ]}。Pu是tRNA分解代谢的最终产物之一,人体无法对其进行再利用,只能直接经尿液排出体外。正常人Pu排泄量较为恒定,很少受饮食干扰,故Pu也能用于对肾功能进行评价^{[ 9 ]}。Cr在一定程度上也能反映肾功能的健康状况^{[ 10 ]}。这些报道说明这4种非蛋白氮代谢产物均在尿液中广泛存在,预示着可以通过对尿液中的这4种代谢产物的含量来预测DN发病与否。

有关非蛋白氮含量测定方法的文献报道很多,主要有高效液相色谱法(HPLC)^{[ 11, 12 ]}、毛细管电泳法^{[ 13 ]}、Jaffe反应法^{[ 14 ]}、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)^{[ 15, 16 ]}、液相色谱-质谱/质谱联用法(LC-MS/MS)^{[ 17 ]}等。其中HPLC具有快速、简单、精密度高等优点,被广泛用于实验室中检测非蛋白氮类化合物。但目前针对这4种非蛋白氮的分离分析,多集中在对某一种或某几种物质的测定上,并无对这4种非蛋白氮实现同时分析的报道。本文建立了一种基于HPLC的分离分析方法,实现对这4种非蛋白氮的同时分离分析。此法具有快速、灵敏度高和重现性好的特点,可用于临床上患者尿液的日常分析和早期肾病的监测。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

高速冷冻离心机(Coulter Avanti J-25,美国BECKMAN公司);高纯水系统(Classic UF,韩国PURELAB公司);高效液相色谱系统(日本岛津公司),包括LC-10Avp液相色谱仪、SIL-10AD自动进样器、SPD-M10Avp二极管阵列检测器和LC Solution工作站。

Cr、Cn和Ua标准对照品(中国天津希恩思生化科技有限公司), Pu标准对照品(中国上海丽臣生物有限公司)。

1.2 标准溶液的配制及样品的前处理

1.2.1 标准溶液的配制

准确称取Cr、Cn和Pu各10.0 mg,其中Cr、Cn和Pu用10.0 mmol/L 磷酸缓冲溶液溶解并定容至10.0 mL,配制成1.0 g/L 的标准溶液。因Ua在磷酸缓冲溶液中溶解度较差,先用8 mL 11.6 mmol/L Na₂CO₃溶解,70 ℃水浴30 min,使Ua充分溶解后,再定容至10 mL,配制成1.0 g/L 的标准Ua溶液。将上述标准储备液用10.0 mmol/L 磷酸缓冲溶液稀释,配制为质量浓度为0.1～250 mg/L 的系列标准混合溶液。

1.2.2 样品前处理

室温解冻尿样,待尿样完全融化后量取3.0～4.0 mL尿液,于4 ℃ 3000 g离心10 min。取上清尿样200 μ L于1.5 mL具塞离心管中,加冷丙酮800 μ L, 4 ℃静置30 min, 12000 g离心15 min除去蛋白质。将上清液真空干燥,并用400 μ L 10.0 mmol/L 磷酸缓冲溶液复溶作为样品原液。取样品原液100 μ L稀释至1 mL,过0.45 μ m膜,HPLC进行分析。

1.3 色谱条件

色谱柱:Waters RP18 Column (150 mm×4.60 mm,3.5 μ m);流动相:10.0 mmol/L pH 4.78磷酸缓冲溶液(A)和乙腈(B);梯度洗脱程序:0～7 min, 1%B～5%B;流速0.8 mL/min;检测波长:220 nm;柱温:室温;进样体积:20 μ L。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

4种非蛋白氮化合物均为碱性化合物,在反相柱上保留行为较差,且会产生较为严重的拖尾现象；为了改善峰形,提高分离度,通常在流动相中引入缓冲盐体系。本实验中通过考察4种非蛋白氮在不同浓度磷酸二氢钾(0.0～20.0 mmol/L)、不同流速(0.4～1.0 mL/min)和不同乙腈体积分数(1% ～80% )下的等度洗脱色谱行为,以保留时间、峰形等为指标,选出最佳缓冲盐浓度、流速以及乙腈体积分数,然后进行梯度洗脱条件优化,从而快速建立最佳色谱条件^{[ 18 ]}。确定的最佳色谱条件为:流动相A为10.0 mmol/L 磷酸缓冲溶液(pH 4.78),流动相B为乙腈;梯度洗脱程序为0～7 min 1%B～5%B;流速为0.8 mL/min。在此色谱条件下,4种常见非蛋白氮的HPLC色谱图见图1a,相关数据见表1。由图1、表1可见,这4种非蛋白氮实现了基线分离,可以准确定量。

表 1 样品的色谱图参数 Table 1 Chromatographic parameters for the samples

图 1 (a)标准混合液及(b)尿样中4种非蛋白氮的HPLC色谱图 Fig. 1 Typical HPLC chromatograms of the four common nonprotein nitrogen substances from (a) standard mixture and (b) urine sample Column: Waters RP18 Column (150 mm×4.60 mm, 3.5 μ m); flow rate: 0.8 mL/min; mobile phase A: 10 mmol/L KH₂PO₄ solution (pH 4.78); mobile phase B: CH₃CN; gradient program: 0-7 min, 1%B-5%B.
Peaks: 1. Cr; 2. Cn; 3. Ua; 4. Pu.

2.2 方法学考察

2.2.1 线性范围及检出限

将配制的不同浓度的4种非蛋白氮标准品溶液在1.3节色谱条件下分别重复进样3次,以质量浓度(mg/L)为横坐标,峰高为纵坐标作图,建立定量标准曲线。以3倍信噪比(S/N=3)确定检出限。结果见表2。由表2可以看出,本方法具有良好的线性关系,相关系数r均大于0.999。

表 2 4种非蛋白氮化合物的线性关系与检出限(LOD) Table 2 Linear relationships and limits of detection (LOD) of the four common nonprotein nitrogen substances

2.2.2 回收率及精密度

为验证方法的可靠性,分别取正常人、DM患者和DN患者尿样各20 mL,经1.2.2节方法处理后,采用加标法对Cn、Cr、Ua和Pu进行分析,并计算回收率和峰高的精密度,实验结果见表3。结果表明4种非蛋白氮的回收率为81% ～111% ,峰高的RSD值均不大于2.78% ,表明方法的重现性良好,所建立的方法可用于实际样品中4种非蛋白氮的分离分析。

表 3 4种非蛋白氮的回收率和相对标准偏差RSD(n=3) Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSD) of the four common nonprotein nitrogen substances (n=3)

2.3 尿样测定

尿样经1.2.2节方法处理后,按1.3节条件进行测定,实际样品色谱图见图1b。采用本文建立的方法,对3个实际样品进行了分析,发现尿液中的非蛋白氮含量存在较大的个体差异。以Pu为例,不同病人晨尿中Pu含量的变化范围为0.01～0.22 g/L,最高值和最低值相差近22倍,而尿液中其余非蛋白氮含量差异为3～13倍,且随着患病情况不同非蛋白氮含量也发生一定规律性变化,Cn和Ua变化尤为明显。

3 结论

本文建立了采用HPLC同时测定尿液中的肌酐、肌酸、尿酸和假尿嘧啶核苷这4种非蛋白氮代谢产物的方法。此方法具有快速、干扰少、重现性高、灵敏度好和所需样品量小的特点,可用于DM和DN患者尿液及其他体液样品的应急检测,为DN早期诊断中测定肌酐、肌酸、尿酸和假尿嘧啶核苷提供了新的方法。

参考文献

[1]	Hirayama A, Nakashima E, Sugimoto M, et al. Anal Bioanal Chem, 2012, 404(10): 3101
[2]	Moreira E D Jr, Neves R C S, Nunes Z O, et al. Diabetes Res Clin Pr, 2010, 87(3): 407
[3]	Zhu C, Liang Q, Hu P, et al. Talanta, 2011, 85(4): 1711
[4]	Sun J, Bhattacharyya S, Schnackenberg L K, et al. Metabolomics, 2012, 8(6): 1181
[5]	van der Kloet F M, Tempels F W A, Ismail N, et al. Metabolomics, 2012, 8(1): 109
[6]	Zhang J, Yan L J, Chen W, et al. Anal Chim Acta, 2009, 650(1): 16
[7]	Hu Y S, Tang Q H, Liu B S. Chinese Journal of Chromatography (胡永狮, 汤秋华, 刘标生. 色谱), 1997, 15(4): 349
[8]	Xia J F, Liang Q L, Liang X P, et al. J Chromatogr B, 2009, 877(20/21): 1930
[9]	Zhou J H, Yuan Y S, Xu D K. Chinese Journal of Chromatography (周继红, 袁倚盛, 许丹科. 色谱), 1998, 16(2): 176
[10]	Xia J F, Hu P, Liang Q L, et al. Clin Biochem, 2010, 43(12): 957
[11]	Peng C H, Wang C F, Li C B, et al. Chinese Journal of Chromatography (彭长华, 王昌富, 李承彬, 等. 色谱), 1998, 16(2): 146
[12]	Xi H, Han G Z, Lü L, et al. Chinese Journal of Chromatography (郗恒, 韩国柱, 吕莉, 等. 色谱), 2011, 29(10): 1000
[13]	Huang H, Chen Z, Yan X. J Sep Sci, 2012, 35(3): 436
[14]	Srisawasdi P, Chaichanajarernkul U, Teerakanjana N, et al. J Clin Lab Anal, 2010, 24(3): 123
[15]	Tsikas D, Wolf A, Mitschke A, et al. J Chromatogr B, 2010, 878(27): 2582
[16]	Zeng K, Liu Z R, Ning Y J, et al. Chinese Journal of Chromatography (曾凯, 刘峙嵘, 宁雅君, 等. 色谱), 2013, 31(5): 477
[17]	Boenzi S, Rizzo C, Di Ciommo V M, et al. J Pharmaceut Biomed, 2011, 56(4): 792
[18]	Kong Y, Zhao Y X, Wang B, et al. Journal of the Fourth Military Medical University (孔宇, 赵永席, 王波, 等. 第四军医大学学报), 2006, 27(7): 668

本文献在全文中的定位：

... DM)最常见的并发症^{[ 1, 2 ]} ...

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... Cn因不被肾小球重吸收而成为使用最广泛的监测肾功能的指标^{[ 2, 7 ]} ...

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... 也是DM患者的主要死亡原因之一^{[ 3 ]} ...

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... 最终导致死亡^{[ 4 ]} ...

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... 寻找DN早期监测指标物是目前面临的重要研究课题^{[ 5, 6 ]} ...

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... Cn因不被肾小球重吸收而成为使用最广泛的监测肾功能的指标^{[ 2, 7 ]} ...

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... 也能反映肾功能的健康状况^{[ 8 ]} ...

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... 故Pu也能用于对肾功能进行评价^{[ 9 ]} ...

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... Cr在一定程度上也能反映肾功能的健康状况^{[ 10 ]} ...

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... 主要有高效液相色谱法(HPLC)^{[ 11, 12 ]}、毛细管电泳法^{[ 13 ]}、Jaffe反应法^{[ 14 ]}、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)^{[ 15 ]}...

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