色谱  2014, Vol. 32 Issue (1): 95-99   PDF (809KB)    
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朱会卷
张卫强
杨艳伟
朱英
高效液相色谱分析化妆品中的防腐剂氯苯甘醚
朱会卷, 张卫强, 杨艳伟, 朱英     
中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所, 北京 100021
收稿日期：2013-7-23
基金项目：国家食品药品监督管理局保健食品化妆品监管司项目([2012]75).
通讯作者：朱英,Tel:(010)67791274,E-mail:zhuying0112@sina.com
摘要：建立了化妆品中防腐剂氯苯甘醚的高效液相色谱检测方法。采用C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)和二极管阵列检测器，以1.0 mL/min甲醇-水(55：45，v/v)为流动相，检测波长为280 nm，柱温为25 ℃。方法的检出限(以3倍信噪比计)可达到3 ng；在1~500 mg/L范围内，峰面积与质量浓度呈良好的线性关系，相关系数为1.0000。高、中、低不同水平的加标回收率为99.0%~103%，相对标准偏差≤1.2%。同时进行了干扰试验和实际样品的测定，并组织3家实验室进行了方法验证。该方法操作简便，准确度、灵敏度和稳定性高，可用于化妆品中防腐剂氯苯甘醚的检测。
关键词： 高效液相色谱     防腐剂     氯苯甘醚     化妆品    
Analysis of the preservative chlorphenesin in cosmetics by high performance liquid chromatography
ZHU Huijuan, ZHANG Weiqiang, YANG Yanwei, ZHU Ying     
Institute for Environmental Hygiene and Health Related Product Safety, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100021, China
Received: 2013-7-23
Abstract: An analytical method was developed for the determination of the preservative of chlorphenesin in cosmetics by high performance liquid chromatography (HPLC). A C18 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) and a photodiode array detector were used. The mobile phase was methanol-water (55:45, v/v) with a flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 280 nm and the column temperature was 25 ℃. The limit of detection was 3 ng. A good linear relationship was obtained between the peak area and the mass concentration of chlorphenesin in the range of 1-500 mg/L and the correlation coefficient was 1.0000. The recoveries of chlorphenesin at different spiked levels were 99.0%-103% with the relative standard deviations (RSD) ≤1.2%. Interference test and sample test were also applied meanwhile and validation experiments were performed by three laboratories. The method is simple, sensitive, accurate, stable and suitable for the determination of chlorphenesin in cosmetics.
Key words: high performance liquid chromatography (HPLC)     preservative     chlorphenesin     cosmetics    

氯苯甘醚(chlorphenesin)对真菌和细菌具有广谱的抗菌作用,在化妆品中常被作为防腐剂使用。近年来在全球范围内屡有文献报道消费者因为使用含有氯苯甘醚的化妆品而引发皮炎[ 1,2,3,4 ]。氯苯甘醚还可使骨骼肌松弛,抑制中枢神经系统并引起呼吸困难。在欧洲,《欧盟化妆品指令》(2009年12月22日)中规定,氯苯甘醚在化妆品中的最大允许使用量为0.30%(质量分数)。在日本,《化妆品标准》(厚生劳动省告示2012年9月29日第331号)中规定,氯苯甘醚不可用于接触黏膜的产品,在不用于黏膜可以被冲洗掉的化妆品和不用于黏膜不可以被冲洗掉的化妆品中,最大允许限额均为0.30% 。在我国,氯苯甘醚作为限用防腐剂在化妆品中使用,《化妆品卫生规范》(2007版)规定,氯苯甘醚属限用防腐剂,化妆品中最大允许使用量为0.3% 。杨艳伟等[ 5 ]对2007年至2010年送检至中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所的化妆品及部分市售化妆品进行了调查,共调查了383份进口化妆品和165份国产化妆品,其中氯苯甘醚的使用频率为4.38% ,且在国产和进口化妆品中差异不大。鉴于氯苯甘醚在国内外化妆品中的普遍应用和由其引发的各种健康安全问题,建立化妆品中氯苯甘醚的检测方法,可对化妆品的监督管理和保护消费者健康权益起到重要作用。

关于氯苯甘醚的检测方法国内外的研究均较少。早期的国外文献中有报道使用气相色谱法[ 6 ]和光谱法[ 7 ],近年的文献报道中Ikarashi等[ 8 ]建立了氯苯甘醚的液相色谱检测方法,但方法特性和样品分析的研究较少。在我国,苏立强等[ 9 ]采用液相色谱法进行了氯苯甘醚对映体的拆分研究。目前尚未检索到化妆品中防腐剂氯苯甘醚检测方法的有关报道。

本研究建立了化妆品中氯苯甘醚快速、准确、灵敏的液相色谱检测方法,进行了方法特性研究、干扰实验和样品测定,并组织3家实验室进行了方法的验证工作。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

Agilent 1100高效液相色谱仪(美国Agilent公司),配二极管阵列检测器(DAD)和自动进样器;T214型万分之一分析天平(北京赛多利斯有限公司);超声波清洗器(Branson公司); Sigma I-6型离心机(德国Sigma公司); IKA MS3型旋涡振荡器(德国IKA公司); Milli-Q Integral 3纯水机(法国Millipore公司)。

氯苯甘醚(纯度99.5% )购于德国Dr. Ehrenstorfer公司;甲醇(色谱纯,Fisher公司);超纯水(18.2 M Ω \5cm, Millipore纯水机制备)。

1.2 标准溶液的配制

标准储备溶液(1000 mg/L):称取氯苯甘醚约0.05 g(精确到 0.0001 g)于小烧杯中,加入甲醇,超声溶解后转移至50 mL容量瓶中,用甲醇溶液定容至刻度,摇匀,配成质量浓度约为 1000 mg/L 的标准储备溶液。

中间工作标准溶液(50 mg/L):移取 1000 mg/L 的标准储备溶液5.00 mL至100 mL容量瓶中,用甲醇溶液定容至刻度,摇匀,配成质量浓度约为50 mg/L 的中间工作标准溶液。

系列浓度标准溶液:移取氯苯甘醚中间工作标准溶液0.20、1.00、2.00、10.0 mL和标准储备溶液1.00、2.50、5.00 mL分置于10 mL具塞刻度管中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,得到质量浓度分别为1.00、5.00、10.0、50.0、100、250和500 mg/L 的标准溶液。

基质标准溶液:将适量氯苯甘醚标准溶液加入不同的化妆品空白基质中，经过样品预处理得到系列基质标准溶液。

1.3 样品预处理

称取样品约0.5 g(精确至0.001 g)于10 mL具塞比色管中,加入流动相(甲醇-水(55 ∶ 45, v/v))至刻度并用封口膜密封,涡旋振摇1 min,超声提取30 min,必要时可高速离心。经0.45 μ m滤膜过滤,滤液作为待测样液备用。

1.4 色谱条件

色谱柱:C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μ m);流动相:甲醇-水(55 ∶ 45, v/v);流速:1.0 mL/min; DAD检测波长:280 nm;柱温:25 ℃;进样量:10 μ L。

2 结果与讨论
2.1 实验条件的选择
2.1.1 色谱柱的选择

参照Ikarashi等[ 8 ]建立的液相色谱法,选取不同型号的4种C18色谱柱:Agilent SB C18(250 mm×4.6 mm, 5 μ m), Diamonsil C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μ m), Agilent HB-C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μ m)和Inertsil ODS-3 C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μ m),按相同的色谱条件进行实验。结果显示,4种C18色谱柱均能得到良好的峰形,C18柱具有较好的通用性,可以根据实际情况进行选择。

2.1.2 流动相的选择

考察了甲醇和乙腈两种有机相分别与水以不同比例混合作流动相时对氯苯甘醚出峰的影响,结果显示在两种有机相下均能得到良好的峰形。考虑到乙腈的毒性较甲醇大,最终选择甲醇作为有机相。考察了以不同比例(60 ∶ 40、 55 ∶ 45、 45 ∶ 55, v/v)的甲醇-水为流动相时氯苯甘醚的出峰情况,氯苯甘醚的出峰时间分别约为6、8和17 min。考虑到样品中基质的干扰及分析效率,最终选择甲醇-水(55 ∶ 45, v/v)作为流动相。

2.1.3 检测波长的选择

根据氯苯甘醚的光谱图(见图1),氯苯甘醚在228 nm和280 nm处有特征吸收。考虑到样品基质可能带来的干扰,选择280 nm作为检测波长;对于氯苯甘醚含量低的样品,可选择228 nm。

图 1 氯苯甘醚的光谱图 Fig. 1 Spectrogram of chlorphenesin



2.1.4 提取溶剂的选择

对液体、乳液、膏霜和固体粉等4种不同基质类型的化妆品分别考察了甲醇和流动相两种提取溶剂,结果显示采用两种提取溶剂的回收率都能满足要求,无显著性差异。实际检测中,可根据具体情况选择不同的提取溶剂。

2.2 方法特性
2.2.1 检出限和线性关系

在设定的色谱条件下,将标准溶液逐级稀释,进样10 μ L。以3倍信噪比(S/N=3)确定检出限(LOD),以S/N=10确定定量限(LOQ),氯苯甘醚的检出限和定量限分别为3 ng和10 ng。

测定不同质量浓度的标准溶液,以目标物的质量浓度( ρ , mg/L)为横坐标、目标物的峰面积(A)为纵坐标建立标准曲线,并进行相关性分析得到线性方程和相关系数(r)(见表1)。同时,对4种不同 基质的标准溶液进行检测分析,记录相应的峰面积 响应值,以目标物的质量浓度( ρ , mg/L)为横坐标,以目标物的峰面积(A)为纵坐标建立方法的标准曲线(见表1)。结果显示,氯苯甘醚在1～500 mg/L 范围内呈现良好的线性关系,且不同基质和标准溶液的线性方程差异不大,因此方法中可直接使用以标准溶液建立的标准曲线进行定量分析。

表 1 氯苯甘醚的线性范围、回归方程和相关系数 Table 1 Linear ranges, regression equations andcorrelation coefficients of chlorphenesin


2.2.2 精密度

用5、100和250 mg/L 高、中、低3个质量浓度的氯苯甘醚标准溶液进行精密度试验,日内分析6次,连续测定6 d,测定日内精密度(RSD)分别为0.80% 、0.34%和0.17% ,日间RSD分别为0.85% 、0.24%和1.4% ,满足技术规范要求[ 10 ]。

2.2.3 准确度

在本方法条件下,向液体类、乳液、膏霜和固体粉类4种不同基质类型的空白化妆品中分别添加5、100、250 mg/L 3个浓度水平的标准溶液,按照确定的样品预处理方法处理,每个水平平行测定6次,分别使用标准曲线和方法标准曲线计算提取回收率和方法回收率[ 9 ],结果见表2。可见氯苯甘醚的高、中、低浓度的提取回收率在100% ～102%之间,方法回收率在99.0% ～103%之间,相对标准偏差均≤1.2% ,满足技术规范要求[ 10 ]。

表 2 氯苯甘醚的回收率(n=6) Table 2 Recovery of chlorphenesin(n=6)
2.2.4 稳定性

取5、100和250 mg/L 3个质量浓度的氯苯甘醚标准溶液,于室温下分别放置0、2、4、8、12、24 h和1～6 d,考察氯苯甘醚标准溶液的日内稳定性和日间稳定性,结果见表3。

试验结果表明，5、100和250 mg/L 标准溶液的日内稳定性的精密度分别为0.77% 、0%和0.25% ,日间稳定性的精密度分别为0.87% 、0.54%和1.4% 。由此可见,氯苯甘醚日内和日间稳定性均较好,有利于实验的开展。

表 3 氯苯甘醚标准溶液的日内和日间稳定性 Table 3 Stabilities of intraday and interday of chlorphenesin standard solution
2.3 样品测定

应用所建立的方法对标识含有氯苯甘醚的7个化妆品样品进行测定,结果见表4,典型样品的色谱图见图2。

表 4 化妆品样品中氯苯甘醚的检出情况 Table 4 Determination of chlorphenesin incosmetic samples

图 2 某一含氯苯甘醚的化妆品样品的色谱图 Fig. 2 Chromatogram of a cosmetic samplecontaining chlorphenesin

由表4可知,7种标识中含有氯苯甘醚的样品均能检出目标物,定性符合率为100% 。通过比较检测值和标识值之间的相对误差评价定量结果的准确度。以相对误差小于20%定为符合,7种样品中有6种含量与标识相符,1种含量与标识不符。含量不符的1种样品性状是液体,这种性状包括在含量相符的6种样品中。为进一步验证结果,对含量与配方不符的样品进行了多人平行试验和加标回收试验,平行试验结果与检测值基本一致,加标试验的出峰时间相同且回收率较好,故基本上可排除基体干扰、回收率低的可能,判断为配方标识有误。由上可见,本法可对样品中的氯苯甘醚进行良好的定性和定量分析。

2.4 干扰试验

考察了我国《化妆品卫生规范》(2007版)中已有检验方法的甲基氯异噻唑啉酮、2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇、甲基异噻唑啉酮、苯甲醇、苯氧乙醇、羟苯甲酯、苯甲酸、羟苯乙酯、羟苯异丙酯、羟苯丙酯、羟苯异丁酯、羟苯丁酯12种防腐剂和苯氧异丙醇共13种防腐剂,结果显示前12种防腐剂对氯苯甘醚不形成干扰,苯氧异丙醇中的微量杂质在与氯苯甘醚相近的保留时间处出峰,但在相同的浓度下响应峰面积低,峰面积比约为1 ∶ 16,且二者的紫外光谱图有差异,故基本可排除干扰。

2.5 验证结果评价

本方法经其他3家实验室验证,检出限、精密度、加标回收率、回归方程的相关系数等指标符合验证要求[ 9 ],结果见表5。

表 5 4个实验室方法特性指标的测定结果 Table 5 Results of method characteristics offour laboratories
3 结论

建立了一种使用高效液相色谱测定化妆品中氯苯甘醚的分析方法。该方法的特异性强、操作简便、灵敏度高、重复性好,不受其他常用防腐剂的干扰;经过另外3家实验室的验证,具有较好的适用性,可用于化妆品中氯苯甘醚的定性和定量分析。
致谢 :感谢北京市疾病预防控制中心的柳玉红和吴大南,广东省疾病预防控制中心的钟志雄、罗志彬和朱炳辉及深圳市宝安区疾病预防控制中心的付斌对本研究提供的方法验证工作。

参考文献
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[3]Wakelin S H, White I R. Contact Dermatitis, 1997, 37: 138
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[10]China Food and Drug Administration. No. 455[2010] Bulletin of China Food and Drug Administration (国家食品药品监督管理总局. 国食药监许[2010] 455号). (2010-11-29). http://www.sda.gov.cn/WS01/CL0846/56461.html