色谱  2014, Vol. 32 Issue (1): 26-33   PDF (1689KB)    
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邢培培
徐杰
丛培旭
王扬
何中央
薛长湖
液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱法高通量分析美国红参的脑苷脂分子种
邢培培1, 徐杰1 , 丛培旭1, 王扬2, 何中央2, 薛长湖1    
1. 中国海洋大学食品科学与工程学院, 山东 青岛 266003;
2. 浙江省水产质量检测中心, 浙江 杭州 310012
收稿日期：2013-8-1
基金项目：国家自然科学基金项目(31201329)；国家“十二五”科技支撑计划项目(2012BAD33B07).
通讯作者：徐杰,Tel:(0532)82031908,E-mail:xujie9@ouc.edu.cn
摘要：利用液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱法(LC-Q-TOF MS/MS)分析美国红参(Parastichopus californicus)脑苷脂的分子种组成。以氯仿-甲醇(2：1，v/v)溶液提取，经皂化和固相萃取柱(SPE)净化后，在正离子模式下，通过自动二级质谱方式同时获取样品脑苷脂分子的一级和二级质谱图。筛取含180 Da中性丢失碎片的分子，再结合二级质谱中的长链碱和脂肪酸碎片，确定每种脑苷脂分子的结构。通过该法一次性共分析出123种美国红参脑苷脂分子种；含有的长链碱共18种，其中植物鞘氨醇型与鞘氨醇型长链碱的相对含量比为1：2；脂肪酸为18~25碳的饱和或单不饱和脂肪酸，以24碳脂肪酸为主，2-羟基脂肪酸占58.62%，饱和与单不饱和脂肪酸的相对含量比约为1：3。LC-Q-TOF MS/MS法分析海参脑苷脂分子种的灵敏度高，准确，简便，为海参脑苷脂的构效关系研究及功能食品开发提供理论依据。
关键词： 液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱法     脑苷脂     分子种     美国红参     高通量分析    
High throughput analysis of cerebroside molecular species from sea cucumber Parastichopus californicus by liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight mass spectrometry
XING Peipei1, XU Jie1 , CONG Peixu1, WANG Yang2, HE Zhongyang2, XUE Changhu1    
1. College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China;
2. Fisheries Quality Testing Center of Zhejiang Province, Hangzhou 310012, China
Received: 2013-8-1
Abstract: Cerebrosides from sea cucumber Parastichopus californicus were identified by using liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight mass spectrometry (LC-Q-TOF MS/MS). The samples were extracted with chloroform-methanol (2:1, v/v) solution and purified by a SPE cartridge. In positive ion mode electrospray ionization (ESI), the precursor ion scan mass spectra and product ion scan mass spectra were obtained through the automatic MS/MS mode. Cerebroside molecules were selected according to the neutral loss fragments of 180 Da, and then were identified according to long-chain base (LCB) fragments and fatty acid (FA) fragments. One hundred and twenty-three cerebroside molecular species were identified. There are 18 species of LCB, and the relative content ratio of phytosphingosines and sphingosines is 1:2. The carbon numbers of fatty acids are mainly 18-25, of which 24 carbon fatty acids are predominant. The relative content ratio of saturated fatty acids and monounsaturated fatty acid is about 1:3, and the presence of 2-hydroxy fatty acids is about 58.62%. LC-Q-TOF MS/MS method is sensitive, accurate and simple. At the same time, this study provided a theoretical basis for structure-activity relationship studies and functional food development of Parastichopus californicus as well.
Key words: liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight mass spectrometry (LC-Q-TOF MS/MS)     cerebrosides     molecular species     Parastichopus californicus     high throughput analysis    

脑苷脂(cerebrosides)为中性鞘糖脂,其结构由神经酰胺(ceramide)和己糖两部分组成,神经酰胺是由长链脂肪酸中的羧基与神经鞘氨醇(又称长链碱,long-chain base, LCB)的氨基经脱水以酰胺键相连形成的一类酰胺类化合物。神经酰胺通过C-1位上的羟基与己糖通过 β -糖苷键连接而成脑苷脂[ 1 ]。脑苷脂广泛存在于菌类、植物类、动物类及海洋生物组织的细胞膜中。不同来源的脑苷脂的结构有明显的差异,哺乳动物中主要为半乳糖型脑苷脂,长链碱主要为鞘氨醇型(d型)的d18 ∶ 0(2-氨基-1,3-二羟基-4-十八烷)和d18 ∶ 1(2-氨基-1,3-二羟基-4-十八烯),脂肪酸一般为16～24个碳的2-羟基或非羟基脂肪酸[ 2, 3 ]。相比之下,海参中脑苷脂的组成具有明显的特异性,其长链碱基同时包括鞘氨醇型和植物鞘氨醇型(t型)两种(见图1),不饱和程度高;糖基主要为葡萄糖[ 4, 5 ];此外,在海参体内还发现有独特的三烯型鞘氨醇[ 6 ]。脑苷脂类化合物主要有抗肿瘤[ 7, 8 ]、缓解肝硬化[ 9 ]、免疫调节[ 10 ]、抗菌[ 11 ]、神经保护[ 12 ]等生物活性。脑苷脂的苷键立体结构、烷基链长度与支链化程度、羟基和双键的个数与位置等与其活性及其吸收代谢密切相关[ 13, 14 ]。故研究其结构对其活性及膳食营养评价有重要意义。

图 1 鞘氨醇与植物鞘氨醇的基本结构 Fig. 1 Basic structures of sphingosineand phytosphingosine

海参脑苷脂的结构及组成分析是研究其构效关系的前提。传统的衍生分析方法除了步骤冗繁外,样品消耗量也较大。近几年来,软电离的离子化方式和高分辨的质量分析技术,以及三重四极杆(triple quadrupole, QQQ)、四极杆-飞行时间(quadrupole-time-of-flight, Q-TOF)、离子阱-飞行时间(ion-time-of-flight, IT-TOF)等串联质谱(MS/MS)技术的发展,为包括脑苷脂在内的鞘糖脂结构鉴定提供了新的技术平台[ 5, 15, 16, 17 ]。其中,QQQ-MS/MS主要用于定量分析,在定性方面有一定的局限性[ 16, 17 ]; IT-TOF MS/MS的灵敏度相对较低[ 5 ]; Q-TOF MS/MS具有分辨率高、灵敏度高、分析速度快、质量范围宽等优点,故对种类多、结构复杂且含量低的分子种定性分析更有优势[ 18 ]。


美国红参(Parastichopus californicus)分布于北太平洋西岸100 m以下的深水海域,是一种产量丰富且具有较高营养价值的可食用海参。目前尚未检索到对于美国红参脑苷脂组成的研究报道,本文建立了基于液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱法(LC-Q-TOF MS/MS)的快速、高通量分析脑苷脂组成的方法,并对美国红参脑苷脂的组成进行了分析,为其营养评价和功能食品的开发提供了参考。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

1290 Infinity Series液相色谱仪、Agilent G6540 Q-TOF质谱仪(美国Agilent公司); AB 135-S分析天平(梅特勒-托利多集团); T10 basic分散机(德国IKA公司); DTU-1C氮吹仪(日本TAITEC公司); Milli-Q Elix-5超纯水系统(美国Millipore公司)。

甲醇(色谱纯,德国Merck公司),乙酸铵、乙酸(色谱纯,美国Sigma公司); SGF254薄层色谱(TLC)硅胶预制板(烟台市化学工业研究所);柱层析硅胶(试剂级,300～400目;青岛海洋化工厂); Supelclean ENVI-18固相萃取柱(3 mL,美国Supelco公司); 0.22 μ m有机滤膜(美国Agela公司)。

美国红参干品:购于青岛市南山市场。

1.2 样品制备

将美国红参干品粉碎为干粉(100～200目)后,称取0.1 g,加入5 mL氯仿-甲醇(2 ∶ 1, v/v)振摇5 min,超声浸提30 min,过滤,反复浸提5遍。滤液用氮气浓缩至干。加入100 μ L的4 mol/L 氢氧化钾溶液以及1.0 mL甲醇,置于37 ℃水浴中皂化1 h,再分散于0.8 mL水中,每次加入2 mL氯仿萃取,共萃取5次,有机相用氮气浓缩至干,得到美国红参脑苷脂粗提物。再通过SPE正相硅胶柱(3 mL)净化,分别以氯仿(3 mL×2)和氯仿-甲醇(90 ∶ 10, v/v; 3 mL×2)洗脱,每3 mL收集一次洗脱液,采用TLC法初步检测收集物的组成及脑苷脂纯度,合并脑苷脂组分,氮气吹干后以500 μ L甲醇溶解,待LC-Q-TOF MS/MS分析。

1.3 LC-Q-TOF MS/MS条件
1.3.1 液相色谱条件

采用Agilent Zorbax Eclipse Plus C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 3.5 μ m);以95%甲醇水溶液(含5 mmol/L 乙酸铵和0.05%乙酸)为流动相等度洗脱,流速0.2 mL/min;柱温30 ℃;进样体积5 μ L。

1.3.2 质谱条件

电喷雾离子源(ESI),正离子扫描模式;干燥气流速5 L/min,温度280 ℃;毛细管电压3.5 kV;喷雾气压力2.1×105 Pa;鞘气流速11 L/min,温度280 ℃;喷嘴电压500 V;裂解电压135 V。一级质谱采集范围m/z 700～900,扫描速率100 ms/scan;自动二级质谱采集范围m/z 100～900,扫描速率100 ms/scan;每次循环分析的母离子数最多为5,离子计数阈值为 2000,碰撞能量为25 eV。

2 结果与讨论
2.1 LC-Q-TOF MS/MS分析海参脑苷脂分子种

在1.3节的条件下,不同脑苷脂分子在所采用的反相液相色谱条件下依照疏水性不同互相分离。图2为美国红参脑苷脂的总离子流图(TIC)及母离子中性丢失色谱图(pNLC,中性丢失碎片180 Da,质谱提取离子窗口设为±0.2 Da),色谱峰重合且信噪比大于10即可判定为脑苷脂色谱峰,依此筛选母离子。然后依次提取不同母离子的二级质谱图,解析其结构。以m/z 836.6离子为例,其提取离子色谱图见图3,其中2号峰为t19 ∶ 3-C24 ∶ 1, 3号峰为其同分异构体d19 ∶ 3-C24 ∶ 1h, 1号峰为m/z 854.6分子在离子源中脱一分子水所形成(其保留时间及二级质谱图与m/z 854.6一致,且质荷比相差18,故推测其为m/z 854.6的脱水峰[ 5 ])。

图 2 美国红参脑苷脂的总离子流图及母离子中性丢失色谱图(中性丢失碎片180 Da) Fig. 2 Total ion chromatogram (TIC) and precursor neutral loss chromatogram (pNLC, neutral loss of 180 Da) of cerebroside from sea cucumber Parastichopus californicus

图 3 m/z 836.6的提取离子色谱图 Fig. 3 Extracted ion chromatogram of m/z 836.6 Peaks: 1. dehydrated ion of m/z 854.6; 2. t19 ∶ 3-C24 ∶ 1; 3. d19 ∶ 3-C24 ∶ 1h.

图4为d19 ∶ 3-C24 ∶ 1h的二级质谱图,可发现明显的LCB(m/z 274.2452)及其脱氨基(m/z 257.2245)的离子碎片,并有脂肪酸(FA)子离子碎片(m/z 382.3648),据此可推测出长链碱为d19 ∶ 3,其脂肪酸链为C24 ∶ 1h。高分辨质谱测得[M+H]+峰的精确质量数为 836.6595,误差为1.8 ppm,可计算出其分子式为C49H89NO9,验证其结构为d19 ∶ 3-C24 ∶ 1h。另外,将其母离子提取色谱图的离子峰以及脱水峰的积分面积相加,采用面积归一化法,得到该结构脑苷脂的相对含量。同理,可分析出其他分子种及其相对含量(见表1)。

图 4 脑苷脂单体d19 ∶ 3-C24 ∶ 1h的二级质谱图、结构及主要碎片裂解途径 Fig. 4 Mass spectrum, structure and main fragmentation pathway of d19 ∶ 3-C24 ∶ 1h LCB: long-chain base; FA: fatty acid; Cer: ceramide.

表 1 LC-Q-TOF MS/MS分析美国红参脑苷脂的分子种组成 Table 1 Molecular species identified of cerebrosides from sea cucumber Parastichopus californicus by LC-Q-TOF MS/MS

另外,采用该方法分析脑苷脂分子种,发现在不同保留时间会出现结构式相同的分子种,如保留时间1.82 min和2.39 min的峰均为t19 ∶ 3-C18 ∶ 0h分子(见表1),推测可能存在两者的LCB双键位置不同,或者LCB末端存在异丙基(iso-)和反异丙基(ante-iso)取代的情况[ 6 ]。

Han等[ 16 ]通过二维液相色谱-电喷雾-三重四极杆串联质谱技术,对大鼠脊髓和脑组织中16种半乳糖脑苷脂进行了定量分析。该方法至少需要两种扫描模式(正、负母离子扫描模式或中性丢失扫描模式、子离子扫描模式),由于QQQ的二级子离子扫描模式不够灵敏,不能得到全面的二级碎片信息,且不能实现自动二级扫描,操作复杂,分析困难。Leila等[ 17 ]通过QQQ的多反应监测扫描(MRM)模式,结合液相色谱的保留时间,定量分析了老年痴呆患者脑苷脂的变化;但该方法只适用于长链碱组成相对简单的哺乳动物,对于分子种类多且结构较复杂的海参脑苷脂具有一定的局限性。Xu等[ 5 ]采用LC-IT-TOF MS/MS分析了3种不同海参的脑苷脂组成差异,从一种海参中最多只筛查出40种脑苷脂。由于离子阱灵敏度相对较低,为了提高检测灵敏度,故将二级质谱的采集范围限定为长链碱的质量范围m/z 200～300,从而损失了其他碎片信息。而本文建立的LC-Q-TOF MS/MS分辨率高,可直接进行元素组成分析,计算出分子式;灵敏度高,质量扫描范围宽,可得到更加全面的二级子离子信息,分析结果更准确;采用自动二级质谱扫描模式,可同时获取样品分子的一级和二级质谱图,既可进行定性分析又能实现一定的定量功能,操作简便,故利用LC-Q-TOF MS/MS分析分子种组成复杂的海参脑苷脂更加有效。

2.2 美国红参脑苷脂分子种分析

采用1.3节方法共分析出美国红参脑苷脂分子种123种(见表1)。结果表明,相对哺乳动物中的脑苷脂分子种,海参脑苷脂的种类及结构更加复杂。其中含量较高的分子种为d19 ∶ 3-C24 ∶ 1h(7.78% , No. 98)、d17 ∶ 1-C24 ∶ 1h(7.72% ,No. 96)、d19 ∶ 2-C18 ∶ 0(4.43% ,No. 38)、d18 ∶ 2-C19 ∶ 0(4.43% , No. 40)、t19 ∶ 3-C24 ∶ 1h(4.41% , No. 19)等,这些分子种在普通哺乳动物中均十分罕见(普通哺乳动物中主要脑苷脂分子种为d18 ∶ 1-C24 ∶ 1、d18 ∶ 1-C24 ∶ 0、d18 ∶ 1-C24 ∶ 0h、d18 ∶ 1-C24 ∶ 1h等[ 2, 3 ])。

利用本方法共分析出美国红参脑苷脂的长链碱18种,其中t19 ∶ 3(21.3% )、d17 ∶ 1(17.9% )、d19 ∶ 3(12.2% )、d18 ∶ 2(11.1% )为其主要长链碱(见图5a)。哺乳动物中长链碱主要为d18 ∶ 1,另有少量的d18 ∶ 0和t18 ∶ 0[ 2, 16, 19 ]。Xu等[ 5 ]分析出仿刺参(Apostichopus japonicus)、叶瓜参(Cucumaria frondosa)、海地瓜(Acaudina molpadioides)3种海参脑苷脂的主要长链碱为d17 ∶ 1、d18 ∶ 2和t17 ∶ 1; Sugawara等[ 19 ]分析出日本花刺参(Stichopus variegates)脑苷脂的长链碱有d17 ∶ 1、d18 ∶ 1、d18 ∶ 2、d18 ∶ 3、d19 ∶ 1、d19 ∶ 2和d19 ∶ 3。而美国红参脑苷脂的长链碱更丰富,发现了罕见的t19 ∶ 3长链碱,且其中植物鞘氨醇型长链碱与鞘氨醇型长链碱含量比约为1 ∶ 2(见图5b)。长链碱对于肿瘤细胞增殖具有良好的抑制作用,且其双键个数、羟基个数、链长对其作用效果影响显著[ 20 ]。由分析结果可以看出,美国红参长链碱结构特殊,因而推测其可能具有较特殊的生物活性。

图 5 美国红参脑苷脂长链碱的相对含量 Fig. 5 Relative contents of LCB in cerebrosides fromsea cucumber Parastichopus californicu a. relative contents of different species of long-chain bases; b. relative content ratio of phytosphingosine and sphingosine.


美国红参脑苷脂的脂肪酸链主要为碳数为18～25的脂肪酸,其中包括饱和和单不饱和脂肪酸,以及2-羟基和非羟基脂肪酸。其长链24碳脂肪酸比例最高(58.02% )(见图6a); 2-羟基脂肪酸为58.62% ,非羟基脂肪酸为41.38%(见图6b);饱和脂肪酸与单不饱和脂肪酸比例约为1 ∶ 3(见图6c)。大鼠脊髓和脑组织中半乳糖脑苷脂的脂肪酸链主要为24碳脂肪酸,2-羟基脂肪酸约占总脂肪酸的一半,饱和脂肪酸与单不饱和脂肪酸比例约为2 ∶ 1[ 16 ]。可见,美国红参的脑苷脂与普通哺乳动物脑苷脂相比,其脂肪酸链长及羟基化程度相似,但不饱和程度明显增加。有研究表明,羟基脂肪酸和长链脂肪酸对于维持中枢髓鞘的结构和功能具有重要影响[ 21 ]。由此推测美国红参脑苷脂可能具有良好的生物活性。

图 6 美国红参脑苷脂中不同脂肪酸的相对含量 Fig. 6 Relative contents of different species of fatty acid in cerebrosides from sea cucumber Parastichopus californicu a. relative contents of different carbon numbers of fatty acids; b. relative content ratio of non-hydroxy fatty acids (NFA) and 2-hydroxy fatty acids (HFA); c. relative content ratio of saturated fatty acids (SFA) and monounsaturated fatty acids (MUFA).
3 结论

本文建立了一种用于脑苷脂分子种高通量筛查及结构分析的高分辨LC-Q-TOF MS/MS方法,灵敏度高,结构信息全面,推测结果更准确,筛查出的脑苷脂分子种类多。该方法的建立为筛查结构差异较大或新结构的脑苷脂单体化合物提供了一条捷径,为构效关系的深入研究奠定了坚实的基础。共分析出美国红参脑苷脂分子种123种,同时发现较少见的t19 ∶ 3等长链碱结构,为美国红参的营养评价及活性研究提供了方法基础。

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