色谱  2014, Vol. 32 Issue (1): 89-94   PDF (1020KB)    
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陈婷
温裕云
欧延
弓振斌
固相萃取净化及超高效液相色谱-串联质谱法测定橡胶制品中的13种N-亚硝胺
陈婷1,3, 温裕云2,3, 欧延2, 弓振斌1,3     
1. 厦门大学近海海洋环境国家重点实验室, 福建 厦门 361102;
2. 福建远东技术服务有限公司, 福建 泉州 362006;
3. 厦门大学环境与生态学院, 福建 厦门 361102
收稿日期：2013-8-1
基金项目：泉州市科技项目(2012FZ17).
通讯作者：弓振斌,Tel:(0592)2186572,E-mail:zbgong@xmu.edu.cn
摘要：建立了固相萃取(SPE)净化、超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)测定橡胶制品中13种N-亚硝胺的方法。样品于密闭萃取瓶中于60 ℃下用甲醇超声萃取30 min，C18固相萃取小柱对萃取液进行净化，经C18色谱柱分离，最后用电喷雾正离子(ESI+)和多重反应监测模式(MRM)对13种N-亚硝胺进行定性、定量测定。实验中对样品前处理、色谱分离条件和质谱检测条件进行了优化。在优化的实验条件下，橡胶样品中添加N-亚硝基二甲胺(NDMA)与N-亚硝基-二乙基胺(NDEA)为500 μg/kg、其他组分均为50 μg/kg时，各组分的相对标准偏差(RSD，n=7)小于10%；在实际样品中的加标回收率为70.7%~117.0%；方法的检出限(LOD，以10倍标准偏差计)为0.5~500 μg/kg。方法可应用于橡胶制品中13种N-亚硝胺的测定。
关键词： 固相萃取     超高效液相色谱-电喷雾电离串联质谱     N-亚硝胺     橡胶制品    
Determination of N-nitrosamines in rubber products by solid phase extraction purification and ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
CHEN Ting1,3, WEN Yuyun2,3, OU Yan2, GONG Zhenbin1,3     
1. State Key Laboratory of Marine Environmental Science, Xiamen University, Xiamen 361102, China;
2. Fujian PFI Fareast Testing & Technology Services Co., Ltd., Quanzhou 362006, China;
3. College of the Environment & Ecology, Xiamen University, Xiamen 361102, China
Received: 2013-8-1
Abstract: A method using C18 solid phase extraction (SPE) for purification and ultra high performance liquid chromatography (UHPLC) coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) for detection was developed to simultaneously determine 13 N-nitrosamines in rubber products. The analytes were extracted with methanol (60 ℃, 30 min) with the aid of ultrasonic technique and then purified by a C18 SPE cartridge. The analytes were separated on a C18 chromatographic column and qualitatively and quantitatively detected by a mass spectrometer with positive ESI at multiple reaction monitoring (MRM) mode. The operating parameters for UHPLC separation and ESI-MS/MS detection were also optimized. Under optimum operating conditions, the relative standard deviations (RSDs, n=7) were less than 10% at spiked level of 50 μg/kg for all analytes except N-nitrosodimethylamine (NDMA) and N-nitrosodiethylamine (NDEA) which were spiked at 500 μg/kg. The recoveries spiked in real samples were from 70.7% to 117.0%. The limits of detection (LODs, 10 times of standard deviation) were in the range of 0.5-500 μg/kg. The method has been successfully applied to the simultaneous determination of the 13 N-nitrosamines in rubber products.
Key words: solid phase extraction (SPE)     ultra high performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry (UHPLC-ESI-MS/MS)     N-nitrosamines     rubber products    

N-亚硝胺是含有-N-N = O基团化合物的总称。N-亚硝胺可通过呼吸道、消化道或皮肤表面吸收进入人体。国际癌症研究总署(IARC)将N-亚硝基二甲胺(NDMA)列入极可能致癌的物质组[ 1, 2 ]。橡胶制品中的N-亚硝胺主要来自以仲胺(如吗啉、二异丙胺等)为基础的硫化促进剂和硫黄给予体,这些物质与空气或配合剂中的氮氧化物(NOX)反应生成稳定的N-亚硝胺[ 3 ];大部分橡胶制品中检出的N-亚硝胺主要来自添加或回收使用含有N-亚硝胺的橡胶原料。为此,欧盟指令明确规定在弹性体、橡胶奶嘴、安抚奶嘴中N-亚硝胺的迁移量不得超过10 μ g/kg[ 4 ],而儿童玩具中不得检出N-亚硝胺化合物[ 5 ];我国对橡胶、弹性体材料中的N-亚硝胺也加以限制,规定其含量不得超过500 μ g/kg[ 6 ]。针对以上要求或含量限制,建立快速、准确测定橡胶制品中N-亚硝胺含量的方法是对橡胶制品化学安全性进行评估的基础,对环境安全和人类健康具有重要的现实意义。

N-亚硝胺的测定方法主要有分光光度法[7]、气相色谱法[8,9,10,11,12]、液相色谱-质谱法[ 13,14,15,16]等,主要应用于化妆品[9]、饮用水[11,12,14,17,18]、水产品[19]或啤酒[8]等样品基质;而液相色谱-串联质谱因灵敏度高、选择性好,适应于橡胶[15]等复杂样品中痕量N-亚硝胺的准确测定。本工作选择欧盟严格限制或禁用的NDMA、N-亚硝基吗啉(NMOR)、N-亚硝基吡咯烷(NPYR)、N-亚硝基甲基乙基胺(NMEA)、N-亚硝基哌啶(NPIP)、N-亚硝基二异丙胺(NDIP)、N-亚硝基-N-甲基苯胺(NMPhA)、N-亚硝基二丙胺(NDPA)、N-亚硝基-N-乙基苯胺(NEPhA)、N-亚硝基二丁胺(NDBA)、N-亚硝基-二乙基胺(NDEA)、N-亚硝基二苯胺(NDPhA)和N-硝基联苄基胺(NDBzA)等13种N-亚硝胺为研究对象, 通过对样品前处理、 色谱分离、 质谱检测等实验条件的选择和优化, 建立了橡胶制品中13种目标物的超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)测定方法。

1 实验部分
1.1 主要仪器和试剂

Agilent 1290超高效液相色谱仪,配置6460串联质谱仪(G4220A Bin Pump, G4226A Sampler, G1316C TCC, G6460 Triple Quad)、Eclipse Plus C18色谱柱(50 mm×2.1 mm, 1.8 μ m)(Agilent Technologies, USA); BHA-9050A浓缩仪(Caliper Life Sciences, USA); KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

甲醇、乙腈为LC-MS级(Merck公司);甲酸、乙酸、甲酸铵和乙酸铵均为LC-MS级(Sigma公司);聚四氟乙烯针式微孔过滤膜(直径13 mm,孔径0.22 μ m;天津津腾实验设备有限公司); C18键合硅胶填料(40～60 μ m,北京振翔工贸有限公司);屈臣氏纯净水(广州屈臣氏集团)。

待测目标物NDMA、NMOR、NPYR、NMEA、NPIP、NDIP、NMPhA、NDPA、NEPhA、NDBA、NDEA、NDPhA和NDBzA均购自AccuStandard公司,纯度大于98.0% 。使用时分别称取适量标准品,用甲醇配制质量浓度为100 mg/L 混合标准储备液,于4 ℃下保存;使用前再稀释配制成合适浓度的混合工作液。

1.2 固相萃取小柱的制备

称取1.0 g硅胶或活性炭、中性氧化铝等填料,装入预先填入适量玻璃棉的6 mL塑料注射针筒中,轻敲击使填料填实,制成硅胶(或活性炭、中性氧化铝)固相萃取小柱,待用。

1.3 样品预处理方法

将待测样品粉碎或剪切至大约3 mm的颗粒,称取1.0 g于10 mL具塞萃取瓶中,加入5 mL甲醇并浸泡样品5～10 min,于60 ℃下超声提取30 min,将提取液转移至氮吹管中;再用5 mL甲醇重复提取一次;合并两次提取液,在浓缩仪上于35 ℃下浓缩至1.0 mL左右,待净化。

将上述浓缩后的提取液转移至实验室自制的C18 SPE小柱中,先用5.0 mL甲醇预淋洗,再用4.0 mL甲醇洗脱,收集流出液并用氮气缓慢吹扫至0.5 mL,最后用甲醇定容至1.0 mL,供LC-MS/MS测定。

1.4 LC-MS/MS条件

LC分离的流动相为甲醇和5.0 mmol/L 甲酸水溶液,梯度洗脱进行待测组分的分离。梯度洗脱程序:0.0～4.2 min,甲醇从30%线性增加至85% ;流速0.4 mL/min;柱温40 ℃;进样量2.0 μ L。质谱测定采用电喷雾正离子电离(ESI+)和多反应监测(MRM)模式。干燥气温度350 ℃,流速3.0 L/min;雾化器压力0.3 MPa,鞘气温度380 ℃,流速8 L/min;毛细管电压 4000 V,喷嘴电压 1000 V。MRM模式的参数见表1。

各目标物的定性分析采用保留时间或母离子/子离子对的丰度比方式进行,以减少误判。如N-亚硝基二丙胺和N-亚硝基二异丙胺为同分异构体,母离子和子离子对相同,但二者的保留时间不同,采用保留时间进行定性;对无法用色谱分离的待测组分,

表 1 13种N-亚硝胺的MRM参数 Table 1 MRM parameters of the 13 N-nitrosamines

图 1 流动相中甲酸浓度对待测组分质谱响应信号的影响 Fig. 1 Effect of formic acid concentration in mobilephase on MS responses of the analytes Concentrations of NDMA, NDEA, NMOR and NDBA: 1.0 mg/L.
则采用不同的母离子/子离子对的丰度进行定性。各待测组分的定量分析使用外标法。

2 结果与讨论
2.1 色谱分离及质谱测定参数优化

待测定的13种N-亚硝胺为中等极性或强极性化合物,使用C18色谱柱进行分离时,在甲醇/水、乙腈/水流动相体系中基线稳定,峰形对称,可实现分离的目的;但在甲醇/水流动相体系中更容易形成质子化的离子[M+H]+,故选择流动相组成为甲醇/水溶液。

实验比较了甲醇分别与甲酸水溶液、甲酸铵水溶液、乙酸水溶液、乙酸铵水溶液组合的4种流动相体系。实验结果表明,甲醇-甲酸水溶液组成的流动相中,13种N-亚硝胺形成[M+H]+的比率较高,可促进各组分在ESI+时的离子化,提高质谱的测定灵敏度。

实验还考察了流动相中甲酸浓度对各待测组分离子化效率的影响。实验结果表明,除极性较小的NMDA、NDEA外,其他11种待测组分的信号强度基本不受甲酸浓度(0.5～5.0 mmol/L)的影响。图1a是待测组分中灵敏度最低的NDMA、NDEA的信号随流动相中甲酸浓度的变化曲线,表明随流动相中甲酸浓度的增加,二者在质谱上的信号响应逐渐增强,当流动相中甲酸含量高于1.0 mmol/L 后,信号响应逐渐平稳,不再受流动相中甲酸浓度的影响。图1b是NMOR、NDBA信号随甲酸浓度的变化曲线,代表了除NDMA、NDEA外其他所有待测组分信号响应不受甲酸浓度影响的情况。其中NDMA与NDEA在5.0 mmol/L 条件下,响应值较大,且响应值稳定,因此实验选择水溶液中甲酸的浓度为5.0 mmol/L。

2.2 待测组分的超声萃取及SPE净化条件

文献[ 20, 21 ]表明,以人工唾液盐为提取剂对橡胶制品进行提取,提取液通过液液萃取或固相萃取富集后可测定橡胶制品中N-亚硝胺的迁移量。本实验分别用二氯甲烷、乙腈和甲醇对橡胶制品中的13种N-亚硝胺进行提取,测定橡胶制品中N-亚硝胺的含量。实验结果表明,3种溶剂均可较好地萃取样品中的N-亚硝胺,考虑到色谱分离时使用甲醇/水流动相体系,故实验中选择甲醇为萃取溶剂。实验中还对超声萃取时间、溶剂用量、萃取次数等进行了优化,最后确定了1.3节的条件。

图 2 (a)13种N-亚硝胺标准溶液、(b)加标样品净化后以及(c)未经净化加标样品的MRM色谱图 Fig. 2 MRM chromatograms of (a) standard solution of the 13 N-nitrosamines, a sample spikedwith the standards (b) after purification and (c) without purification

橡胶样品的基质复杂,大量共存杂质与待测物可同时被萃取,在离子化过程中这些杂质可能抑制或增强待测组分的离子化,进而影响各组分检测的灵敏度[ 22, 23 ]。为此,实验考察了分别填装C18键合硅胶、活性炭(80目,果壳质,国药集团化学试剂有限公司)及中性氧化铝(100～200目,国药集团化学试剂有限公司)的3种自制SPE小柱对样品的净化效果。结果表明,空白样品中添加待测组分500 μ g/kg 时,采用活性炭、中性氧化铝对样品进行净化,其加标回收率为26.4%(NDEA)～47.6%(NDBA)之间;而采用C18键合硅胶小柱净化,加标回收率在70.9%(NMPhA)～117.0%(NDIP)之间;该结果说明活性炭、中性氧化铝对SPE小柱对样品的净化效果较差,C18键合硅胶小柱的净化效果较好。图2为标准溶液、样品使用C18键合硅胶小柱净化以及样品未经净化时各待测组分的MRM色谱图。由图2可明显看出,使用C18键合硅胶净化与未经净化,NMPhA的净化效果最差,样品基质抑制了目标物的离子化;而NDIP净化后仍然保留了部分样品基质,增强了离子化;其他组分的净化效果较好,基本上去除了影响准确测定的样品基质。

2.3 方法的精密度和准确度

选取不含或待测组分含量较低的实际样品,平行称取7份各1.0 g的橡胶样品分置于10 mL萃取瓶中,添加50 μ g/kg(NDMA与NDEA为500 μ g/kg)水平的待测组分,放置过夜,然后进行萃取、测定,计算方法的相对标准偏差(RSD)。结果表明,各组分的RSD(n=7)为0.8% ～9.7% ,方法具有较好的稳定性,能满足橡胶样品中N-亚硝胺测定的要求。

在5份质量均为1.0 g的样品中添加待测组分的标准溶液,添加水平分别为50、100、200、500 μ g/kg,放置过夜后进行萃取、测定,计算方法的加标回收率。结果表明,加标回收率在70.7% ～117%之间,表明方法可用于橡胶制品中13种痕量N-亚硝胺含量的测定。

2.4 方法的线性范围和检出限

在优化后的色谱-质谱条件下进行测定，以标准工作溶液中目标组分的质量浓度( μ g/L)为横坐标，目标组分定量离子的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果表明，13种N-亚硝胺组分在各自的浓度范围(见表2)内有良好的线性关系，相关系数均大于0.998。 选取不含或待测组分含量较低的实际样品,依照所建立的方法对样品进行平行(n=7)测定,计算该样品平行测定的标准偏差(SD);定义10倍SD所对应的含量为方法的检出限(LOD),表2列出了该方法的LOD。

2.5 实际样品测定

为验证方法对常见橡胶产品的适用性,于超市购买橡胶鞋(鞋底)、抗震垫、奶嘴等可能含有N-亚硝基组分的典型样品进行测定,结果见表3。结果表明,虽然样品中所含N-亚硝胺的化学组成有差异,但所有测试样品中均检出N-亚硝胺,且N-亚硝胺的含量远高于欧盟或我国对橡胶、弹性体材料中N-亚硝胺含量的规定。

表 2 方法的精密度(RSD)、加标回收率及检出限 Table 2 Method precisions, spiked recoveries and LOD of the analytes

表 3 实际样品中13种N-亚硝胺的含量 Table 3 Contents of the 13 N-nitrosamines in realrubber samples
3 结论

通过对样品萃取、净化以及色谱分离、质谱测定条件的优化,建立了准确测定橡胶等复杂基质中13种N-亚硝胺的SPE-UHPLC-MS/MS方法。方法的样品前处理简单,后续分离、测定时间短,为橡胶制品中多种N-亚硝胺的同时测定提供了简单、实用的方法。

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