酚类化合物是植物中分布最广泛的次生代谢产物之一,由莽草酸-苯丙素代谢途径产生,经常与糖、其他酚类物质或多胺结合来储存或排除苯丙素中间体[ 1 ]。烟草中的酚类物质除了调节烟草生长、抗病毒、增强抗逆性等生理功能[ 2 ]外,还具有抗氧化性、抗人类免疫缺陷病毒(HIV)活性、细胞毒性等生物活性[ 3, 4 ],对烟叶的色泽、等级、香味和烟气生理强度等起重要作用,是衡量烟草品质的重要指标。
国内外用于烟草酚类的检测方法主要有滴定法、光谱法[ 5 ]、毛细管电泳[ 6 ]和色谱法等,前两种方法主要用于测定酚类总量,对于快速分离检测各种酚类物质,色谱法有显著优势。最常用的为气相色谱法[ 7, 8 ]及液相色谱法[ 9, 10, 11, 12, 13, 14 ],但由于酚类物质沸点较高难挥发,且高温下不稳定易分解,利用气相色谱法需要衍生化,操作步骤繁琐,故液相色谱法更受青睐。谷勋刚等[ 10 ]应用加速溶剂萃取-液相色谱法测定了醇化后干烟末中的6种多酚类化合物;李福娟等[ 11 ]优化了9种天然多酚类化合物的液相色谱分离条件,并测定了实际烟草样品中芸香苷和绿原酸的含量;赵瑞峰等[ 13 ]建立了卷烟烟丝中绿原酸、芸香苷、莨菪亭的超高效液相色谱快速检测方法,并确定了微波辅助萃取的最佳提取条件;Torras-Claveria等[ 14 ]应用高效液相色谱-电喷雾电离串联质谱法鉴定了烟草中的20种酚类化合物,并分析了衰老烟草及水分胁迫烟草中的酚类物质。
尽管如此,对于烟草酚类的研究还存在许多不足,已有文献研究的对象主要集中在烤后烟、卷烟等,对于新鲜烟叶研究甚少,并且往往局限于绿原酸、芸香苷及莨菪亭等很少的几种酚类物质,忽视了一些酚类异构体及羟基肉桂酸酰胺类物质[ 15, 16 ],分析覆盖面很窄。研究新鲜烟叶可以更准确地分析与烟叶生长相关因素的影响,如能够研究新鲜烟叶酚类含量与气象的关联,研究各酚类物质在生育期的累积规律,为下一步关键调控机理和有效调控手段的研究奠定基础。本文建立了烟叶中25种酚类物质的高效液相色谱-紫外/质谱(HPLC-UV/MS)检测方法,不但能够通过紫外检测实现11种主要酚类物质的快速检测及内标标准曲线法绝对定量,而且通过四极杆-飞行时间质谱(Q-TOF)极强的定性能力鉴定了另外14种酚类物质的可能结构,经内标校正可实现半定量分析,国内很少有对烟草中这14种酚类物质的报道。该方法快速准确,酚类物质分析覆盖面广,已应用于不同产地的新鲜烟叶样本中酚类物质的分析。
岛津LC-20A(日本Shimadzu公司); Agilent 6510 Q-TOF LC-MS液相色谱-质谱联用仪(Agilent公司);超声波发生器(美国Branson公司);台式冷冻干燥机(美国Thermo公司); Milli-Q超纯水处理仪(Millipore公司); Blofuge Stratos离心机(美国Thermo公司)。
新绿原酸(纯度≥98% , Sigma公司)、绿原酸(纯度≥95% , Aldrich公司)、隐绿原酸(纯度≥98% , Sigma公司)、莨菪苷(纯度≥99% ,上海源叶生物公司)、莨菪亭(纯度≥99% , Sigma公司)、芸香苷(纯度≥95% , Sigma公司)、香豆素(纯度≥97% , Fluka公司)、山萘酚(纯度≥90% , Sigma公司)、山萘酚苷(纯度≥95% , Chromadex公司)、咖啡酸(纯度≥98% , Sigma公司)、阿魏酸(纯度≥99% ,百灵威公司)、牡荆黄素(纯度≥98% , Sigma公司,内标);甲醇、乙腈(色谱纯,Merck公司),纯度不小于99.9% ;乙酸(色谱纯,Sigma公司),纯度不小于99.7% ;水为超纯水。
内标萃取液:以甲醇/水(4 ∶ 1, v/v)为溶剂,配制牡荆黄素质量浓度为12 mg/L 的内标萃取液。
标准溶液:分别准确称取适量11种标准品,用内标萃取液溶解、稀释配制成质量浓度为2 g/L 的标准储备液,于-20 ℃下保存备用。准确吸取适量上述标准储备液,用内标萃取液稀释配制得到各浓度的混合标准溶液,绿原酸及芸香苷的质量浓度为0.95～380.00 mg/L;其他9种标准品的质量浓度为0.90～99.00 mg/L。
准确称取25 mg新鲜烟叶粉末,加入2 mL内标萃取液,涡旋5 s混匀后超声萃取20 min,以 10000 r/min 离心7 min,取上清液经0.22 μ m有机相滤膜过滤后分两份,分别进行HPLC-UV和HPLC-MS测定。
有标准品的酚类物质采用HPLC-UV检测,内标标准曲线法绝对定量分析。HPLC-UV条件:色谱柱Symmetry C18(250 mm×4.6 mm, 5 μ m),柱温30 ℃,检测波长340 nm,进样量5 μ L,流速1.0 mL/min,流动相A为水/甲醇/乙酸(44/5/1, v/v/v), B为甲醇/水/乙酸(44/5/1, v/v/v)。梯度洗脱:0～15.0 min, 10%B～30%B; 15.0～26.0 min, 30%B～90%B; 26.0～28.0 min, 90%B; 28.1～35.0 min, 10%B。
无标准品的酚类物质用HPLC-MS检测,内标校正半定量分析。HPLC-MS条件:Agilent SB-AQ色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μ m),柱温50 ℃,进样量3 μ L,流速0.30 mL/min,柱后无分流引入质谱,流动相A为0.1%乙酸水,B为乙腈。梯度洗脱:0～2.0 min, 5%B～15%B; 2.0～10.0 min, 15%B～25%B; 10.0～12.0 min, 25%B～95%B; 12.0～15.0 min, 95%B; 15.1～23.0 min, 5%B。MS条件:电离方式ESI+,质量扫描范围100～1000,氮气温度350 ℃,干燥气流速9 mL/min,毛细探针电压4 000 V,溶剂化离子去簇电压175 V,锥孔电压65 V,八极杆电压750 V。
本批新鲜烟叶样品有76份,分别来自于云南(40个)、河南(17个)及贵州(19个)。所有样品均经过冷冻干燥后研磨成粉,并置于-80 ℃下低温保存。
甲醇与大部分酚类物质能良好共溶,是酚类物质的优良提取剂,文献普遍采用50% ～80%(v/v)甲醇水溶液提取酚类物质[ 11, 12, 13 ]。本实验选择80%甲醇水溶液(含内标)作为萃取液,并对料液比进行优化。分别称取10、15、25、35、50 mg新鲜烟叶粉末,用2 mL萃取液按1.3节进行样品处理后进行HPLC-UV分析。结果显示在15～35 mg内,样品量与各酚类物质的相对峰面积(酚类物质峰面积与内标牡荆黄素峰面积的比值)呈现良好的线性,线性相关系数在 0.9994～1.0000 之间,说明2 mL萃取液能够将15～35 mg中的主要酚类物质提取完全,本实验最终选择样品量为25 mg。
文献[ 4, 17 ]分析比较了超声萃取及回流萃取对烟草中酚类物质提取效率的影响,发现超声萃取更简单有效。本实验考察了超声5、10、20、30、40、50 min对酚类物质萃取效率的影响,结果显示超声时间对酚类物质萃取效率的影响不明显。鉴于超声20 min的提取效果相对稳定,故选择超声20 min。
本实验中假设所有目标物与同一内标的峰面积比值跟目标物与内标在样品中的浓度成正比,且校正因子均为1,以此求得所有目标物相对于同一内标的相对含量值。
在HPLC-UV分析时,由于甲醇-水作流动相时酚羟基易产生电离,在固定相表面有双重保留机制,一些酚类物质难以得到很好的分离,加入乙酸能抑制酚类物质电离。本实验以甲醇/水/乙酸作为流动相,考察了乙酸的体积分数(0.25% ～2.5% )及柱温(25～40 ℃)等的影响。综合考虑分离效率及分析时间,最终确定乙酸的体积分数为2% ,柱温30 ℃时为最佳分析条件。另外,11种酚类物质在340 nm的检测波长下均有较强的吸收,能够满足所有酚类物质的检测要求。
对HPLC-MS方法的色谱柱、流动相配比等进行了优化,最终确定了0.1%(v/v)乙酸水溶液/乙腈为最佳流动相,优化后的梯度见1.4节实验部分。对于质谱条件的选择,在未知物结构识别时采用正、负离子模式相结合的方式,在实际样本分析时由于正离子模式能提供更多的峰信息,因此采用正离子模式。
对于可获得商品化标准品的11种酚类物质,可通过保留时间及MS/MS对样品中的这些酚类物质进行定性。对缺少标准品的酚类物质,其定性基于文献中的去质子化或质子化的分子离子以及其他相似化合物的断裂规律[ 14, 18 ]。利用HPLC-UV及HPLC-MS正负离子模式,结合MS/MS,共定性了25种酚类物质(见表1),其中有16种能在新鲜烟叶中稳定存在,其余9种在新鲜烟叶中含量较低,不能稳定检测到。图1a、b分别为11种酚类物质标准品的HPLC-UV色谱图及新鲜烟叶中稳定存在的8种酚类物质(有标准品)的HPLC-UV色谱图,c为另外8种酚类物质(无标准品)的HPLC-MS提取离子图。
将1.2节所配制的系列混合标准溶液分别进样测定,以相对峰面积(酚类物质峰面积与内标峰面积的比值)为纵坐标(Y),质量浓度为横坐标(X, mg/L),计算每个酚类组分的标准曲线及相关系数；继续稀释混合标准溶液以测定每种物质的检出限和定量限(以3倍信噪比确定检出限,10倍信噪比确定定量限)；结果见表2。由表2可知,在一定的样品浓度范围内,各酚类标准品的质量浓度与相对峰面积具有很好的相关性,且检出限较低,为8.0～132.2 μ g/L。此外选取了咖啡酸、绿原酸、山萘酚苷、芸香苷4种标准物质,考察了基于HPLC-MS半定量方法的单调性,相关系数为 0.9906～0.9957,表明该方法具有良好的单调性。另外,根据公式:定量校正因子(fm)=(标准品质量×内标物峰面积)/(内标物质量×标准品峰面积)，求得各酚类标准品的定量校正因子,见表2。
准确称取6份新鲜烟叶粉末样品进行平行处理,测定HPLC-UV及HPLC-MS方法的重复性;选择其中一份试样连续进样8针检测仪器的日内精密度,将该份试样每天连续进样8针重复4天检测仪器的日间精密度;另外,选择一份试样每隔12 h连续进样4针,检测样品在常温条件下48 h内的稳定性。结果见表3。从表3可见,该法呈现了很好的重复性(RSD为 1.48% ～13.40% )和日内、日间精密度(RSD为0.35% ～15.54% )。另外,样品在48 h内也呈现了较好的稳定性,RSD为0.42% ～11.74% 。
用新鲜烟叶粉末作为基质,在22.5～24.8、45.0～49.5、67.5～74.3 mg/L 3个水平进行加标回收率实验,每个水平重复3次,回收率见表4。11种酚类物质的加标回收率为91.0% ～112.4% , RSD为0.33% ～8.11% ,说明本方法重复性好,准确度高。
采用本方法对云南、河南、贵州的成熟期新鲜烟叶样品进行了分析,图2为3个产地新鲜烟叶中16种酚类物质含量的偏最小二乘判别分析(PLS-DA)得分图。由图2可见,不同产地间能明显区分,贵州与云南较接近,与河南差异大,且河南组内差异大。说明3个产地间的某些酚类物质含量有明显差异,且河南的酚类物质含量较云南及贵州差异更大。
3个产地两两分别比较,保留PLS-DA模型中VIP值大于1且非参数检验有显著差异(p＜0.05)的代谢物,三组结果取并集得到3个产地的差异代谢物。结果除隐绿原酸、香豆素、咖啡酰丁二胺II、咖啡酰丁二胺III外,其他12种酚类物质均为差异代谢物。
绝对定量分析的8种酚类物质总量为贵州(24.77 mg/g)＞云南(22.47 mg/g)＞河南(21.04 mg/g),贵州与河南两地间存在显著性差异;芸香苷含量为云南(9.44 mg/g)＞贵州(8.24 mg/g)＞河南(6.24 mg/g),且相互间均存在显著性差异。苏强等[ 19 ]测得云南及贵州初烤烟叶多酚含量显著高于其他地区,且云南的芸香苷含量最高,这与本实验所得的结果一致。在地理位置上,贵州及云南毗邻,处于中高海拔地区,而河南处于低海拔地区。尹永强等[ 20 ]认为在具有一定海拔高度的地区种植烤烟有利于清香型致香物质的积累,酚类物质正是清香型倾向指标之一。另外,本实验测得绿原酸含量为贵州＞河南＞云南,山萘酚苷含量为云南＞贵州＞河南,河南的新绿原酸、莨菪亭、阿魏酰丁二胺II显著高于云南及贵州。
针对烟叶中存在的酚类物质,建立了基于HPLC-UV的绝对定量分析方法和基于HPLC-MS的半定量分析方法,两者结合可实现25种酚类化合物的快速检测及分析。方法验证结果表明:在测定的浓度范围内两种方法均呈现了很好的线性、预处理重复性及日内、日间精密度;加标法测定的低中高水平下的回收率及样品稳定性均满足实验要求,可用于烟叶中酚类物质的分析。采用本方法对云南、河南、贵州的成熟期新鲜烟叶样品进行了分析,在新鲜烟叶中可稳定测得16种酚类物质,3个产地间除隐绿原酸、香豆素、咖啡酰丁二胺II、咖啡酰丁二胺III无显著差异外,其他12种酚类均为差异代谢物。其中芸香苷、山萘酚苷含量为云南＞贵州＞河南,且相互间有显著性差异;河南的新绿原酸、莨菪亭、阿魏酰丁二胺II显著高于云南及贵州;另外,主要酚类物质总量为贵州＞云南＞河南,贵州与河南两地间存在显著性差异。
2014, Vol. 32 Issue (1): 40-46
PDF (921KB)
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