游离氨基酸是烟草中重要的化学成分,其代谢与栽培、调制、醇化密切相关。此外,游离氨基酸与烟叶中的还原糖类物质发生非酶棕色化反应,生成Amadori化合物,直接影响烟草的香气品质[ 1，2 ]。烟草化学成分主要受烟草品种、种植地域生态条件、栽培措施、加工过程等因素影响[ 3 ]。对全国主要产区调制后烤烟的游离氨基酸进行含量分析,寻找其变化规律,对提升烤烟品质有重要意义。
氨基酸的分析方法主要有氨基酸自动分析仪法[ 4, 5, 6 ]、气相色谱法[ 7, 8, 9, 10, 11 ]和液相色谱法[ 12, 13, 14, 15, 16 ]。目前,国内外应用比较广泛的是气相色谱-质谱联用(GC-MS)[ 7, 8, 9, 10 ]和液相色谱-质谱联用(LC-MS)[ 13, 14, 15, 16 ]法。氨基酸极性较强,为提高其在反相液相色谱柱上的保留,常常需要将氨基酸进行柱前衍生[ 7, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ]。常用的衍生试剂有氯甲酸丙酯(NPCF)[ 8 ]、异丁基氯甲酸酯(IBCF)[ 9 ]、邻苯二甲醛(OPA)[ 17 ]、2,4-二硝基氟苯(DNFB)[ 18 ]、异硫氰酸苯酯(PITC)[ 19 ]、6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯(6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate, AQC)等[ 20, 21, 22 ]。AQC可与一级、二级氨基酸反应,迅速生成高稳定性的脲,且衍生副产物不干扰测定,衍生时抗盐等基质干扰能力强,在游离氨基酸的测定中获得了广泛应用[ 20, 21, 22 ]。文献中报道的氨基酸AQC衍生物一般采用紫外或荧光检测[ 21, 22 ],但用于复杂基质样本的氨基酸检测时易受到共流出峰的干扰。
烤烟游离氨基酸的研究主要集中在不同生长时期、品种、种植环境、施肥量等对游离氨基酸含量的影响,以及烘烤前后、调制发酵后氨基酸的含量变化等[ 1, 5, 23, 24 ]。如刘荣森等[ 1 ]研究了同一地点种植的8个烤烟品种的游离氨基酸含量,发现氨基酸在不同品种间存在差异。赵田等[ 5 ]对产自四川的8种不同类型烟草游离氨基酸的组成和含量进行了比较,研究发现不同类型烟草的游离氨基酸组成和含量有较大差异。但对全国范围内的主要烤烟种植区主栽品种的游离氨基酸含量规律研究鲜有报道。
本课题组已建立了AQC柱前衍生-超高效液相色谱-单重四极杆质谱检测(UPLC-SQD)、质谱分段扫描方法[ 25 ],该方法简单,重复性好,采用选择性离子扫描可以避免共流出峰的干扰。与三重四极杆质谱多反应监测方法(MRM)相比,虽然方法的灵敏度略低,但方法建立简单,且所需仪器价格便宜,更易推广。将该方法优化后用于2011年度采收自全国14个种植省份的调制后烤烟烟叶的游离氨基酸含量进行研究,采用单变量和多变量统计分析研究不同香型、不同产地烤烟的游离氨基酸变化规律。
烟叶样本:烟叶样本选取2011年在全国主要烟草种植省份采收的烤烟中部叶片。烟叶产地选取国内公认代表性最强、生产历史悠久、风格特色鲜明的传统产区,包括14个种植省份:河南、山东、安徽、陕西、广东、湖南、江西、贵州、重庆、黑龙江、湖北、云南、福建和四川省。依据感官专家评价,以上烟叶样本可划分成浓香型、清香型及中间香型3大类。烟叶烘烤结束后放置样本库统一存放,自然醇化半年后,磨成40～60目粉末,放置-20 ℃保存,直至样本分析。
Waters ACQUITY-UPLC配置ACQUITY SQ检测器(美国Waters公司), AE-100电子天平(瑞士Mettler公司), 5510E-DTH超声波清洗机(美国Branson公司), DT5-2型低速台式离心机(北京时代北利离心机有限公司), A1197涡旋混匀器(荷兰Breda公司);液相色谱分析柱为ACQUITY UPLC BEH C18 (100 mm×2.1 mm, 1.7 μ m,美国Waters公司)。
21种氨基酸标准品(Sigma-Aldrich公司):组氨酸(His)、天冬酰胺(Asn)、丝氨酸(Ser)、谷氨酰胺(Gln)、精氨酸(Arg)、甘氨酸(Gly)、高丝氨酸(Homoser)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、苏氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、 γ -氨基丁酸(GABA)、脯氨酸(Pro)、赖氨酸(Lys)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)、正缬氨酸(Nval)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)。乙腈(德国Merck公司),甲酸(J&K公司);甲酸铵(Sigma-Aldrich公司), AccQ\5TagTM试剂盒(Waters公司);去离子纯化水使用Millipore水纯化系统制备(美国Millipore公司)。
准确称取烟叶粉末40 mg于5 mL玻璃螺纹管中,加入2 mL超纯水(含内标正缬氨酸5 mg/L),用循环冷却水控制温度超声提取45 min, 3000 r/min 离心,0.22 μ m水膜过滤。移取70 μ L硼酸缓冲液于EP管中,加入10 μ L样品溶液涡旋数秒加入20 μ L衍生试剂,涡旋混匀后置于55 ℃水浴中加热10 min,取出冷却至室温后进样分析。
色谱条件 流动相A: 20 mmol/L 甲酸铵-0.5%(v/v)甲酸-1%(v/v)乙腈-98.5%(v/v)水;流动相B: 1.6%甲酸-98.4%(v/v)乙腈;流速:0.35 mL/min;柱温:55 ℃;进样体积:1 μ L;进样器温度:15 ℃。液相色谱的梯度条件为:0～1.08 min, 0.1% B; 1.08～11.48 min,从0.1% B线性上升到9.1% B; 11.48～16.30 min,从9.1% B线性上升到21.2% B; 16.30～16.90 min,从21.2% B线性上升到59.6% B,并保持到18.10 min; 18.10～18.28 min,从59.6% B线性下降到0.1% B,并保持到19.82 min。
质谱条件 SQD条件电喷雾离子源正离子模式(ESI+),分段选择离子检测(selected ion recording, SIR): 3～7 min, m/z 303、326; 5.5～10 min,m/z 246、276、290、304、317、345; 8～13 min,m/z 260、274、286、290、318; 12～15.5 min,m/z 288、352、487; 14～17.5 min,m/z 302、336、375。毛细管电压3 kV,锥孔电压30 V,去溶剂气温度300 ℃,锥孔温度120 ℃,去溶剂气体流速650 L/h,进样锥气体流速50 L/h。
采用AQC柱前衍生UPLC-SQD方法对烤烟中的游离氨基酸进行分析,图1为典型烤烟样本的分析谱图,共有20种游离氨基酸在18 min内得到了很好的分离。
基于本实验室已建立的AQC柱前衍生-UPLC-SQD质谱分段扫描方法[ 25 ],将烤烟样品用量减少至40 mg,超声提取时间缩短至45 min,并增加了烤烟中的痕量Homoser检测。对优化后的方法进行了表征,考察了方法的重复性,日内、日间精密度,检出限(LOD),定量限(LOQ)和回收率,方法表征结果见表1。平行处理6份烤烟样本,考察方法的重复性,结果表明除Homoser外,其他游离氨基酸的RSD均小于10% 。同一样本日内重复进样6次,得日内RSD为1.90% ～9.83% ;同一样本连续进样4天,每天重复进样6次,得日间RSD除Homoser外均小于13% 。配制一系列含有内标溶液的20种氨基酸标准溶液,测定线性范围,结果表明氨基酸的线性范围良好,其中Gly的线性范围最宽,为0.008～12.5 mg/L,线性相关系数(r2)均大于0.995。分别以S/N=3和S/N=10确定方法的检出限和定量限(以衍生前氨基酸的质量浓度计),检出限为1.9～17.8 μ g/L,定量限为6.4～59.4 μ g/L。分别配制浓度约为烤烟中相应氨基酸含量的50% 、80%和100%的氨基酸样本溶液(内标Nval均为5 mg/L)加入烤烟样品,测定加标回收率,结果显示,低、中、高3个水平的平均加标回收率为96.84% ～103.48% ,方法满足分析要求,可以用于烟叶中游离氨基酸的定量分析。
为了保证样本分析过程中实验数据的可靠性,每10个样本插入1个质控样本(QC),整个分析序列中共插入15个QC样本。QC样本中游离氨基酸含量的RSD的分布如图2所示。除烟叶样本中含量较低的Homoser(烟叶中的含量为 μ g/g)外,其余游离氨基酸含量的RSD均小于20% ,方法的重复性满足实验要求,可进行下一步的数据统计分析。
传统上国内烤烟依据香气特点主要分为浓香型、清香型和中间香型3个典型香型。将从14个烤烟种植省份采收的138份调制后烟叶中部叶片依据 香型分成浓香型、清香型和中间香型3组,包括浓香型50个样本、清香型47个样本、中间香型41个样本,3种香型烟叶的游离氨基酸含量见表2。
由表2可知,烤烟中Pro、Asn、Gln、Ala、Glu的含量较高,其总和约占游离氨基酸总量的90% ,其中含量最高的Pro约占游离氨基酸总量的2/3; Homoser(0.6～6.3 μ g/g)和Ile(2.4～20.1 μ g/g)的含量较低,其和仅占氨基酸总量的0.11% 。从总体上来说,3种香型烤烟游离氨基酸总量为浓香型＞清香型＞中间型,但3种香型间游离氨基酸的含量差异不大。烤烟游离氨基酸含量在不同产地间的差异较大,其中有12种氨基酸的RSD大于50% , Asn、Gln、Lys的RSD超过80% 。浓香型烤烟的氨基酸含量RSD在31.82% ～106.80% ,其中RSD超过50%的游离氨基酸有17种,Asn和Lys的RSD超过100% ;清香型烤烟氨基酸含量的RSD在26.79% ～72.88% ,其中RSD超过50%的游离氨基酸有7种;中间香型产地烤烟氨基酸的RSD在21.65% ～81.40% ,其中RSD超过50%的游离氨基酸有8种。浓香型产地烤烟游离氨基酸的RSD远高于其他两种香型。同一香型产区烤烟的游离氨基酸含量变异较大,可能与产地的土壤、气候等生态因素有关[ 26, 27 ]。为此,对同一香型不同种植省份和同一省份不同香型产区烤烟的游离氨基酸进行研究。
将50个浓香型烤烟样本按照烟草种植区分为黄淮产区、东南产区和长江中上游产区3组[ 27 ],其中黄淮烟草种植区21个样本(河南16个、山东5个),东南烟草种植区24个样本(湖南9个、广东5个、江西5个和安徽皖南5个)以及长江中上游烟草种植区的陕西省5个样本。将所有浓香型样本进行主成分分析(PCA), PCA得分图见图3。可以看出,3个种植区的浓香型样本在PCA上有明显的分类趋势。黄淮产区和东南产区烤烟在第一主成分(PC1)方向差异较大。陕西省居于两个种植产区中间。
将3组样本两两比较做非参数Mann-Whitney U检验(见表3)。由表3可知,黄淮产区烤烟的游离氨基酸含量显著高于东南产区,大部分游离氨基酸含量是其2～5倍,其中Gln相差达6倍,两个产区的烤烟中20个游离氨基酸均有显著性差异(p＜0.001)。陕西省烤烟与黄淮产区或东南产区相比,部分游离氨基酸有显著性差异(p＜0.05),游离氨基酸总量为黄淮产区＞陕西省＞东南产区。
47个清香型烤烟样本主要来自西南产区3省(云南27个、贵州5个和四川5个)和东南产区的福建省(10个)。将所有清香型样本进行PCA统计分析,PCA得分图见图4。东南产区的福建省和西南产区3省在PC1方向有分类趋势。
将样本分成西南产区(云南、贵州和四川)和东南产区的福建省2组,对2组样本做非参数Mann-Whitney U test检验,结果见表4。由表4中结果可知,西南产区烤烟游离氨基酸含量较福建高,其中有显著性差异的游离氨基酸有:His、Asn、Ser、Gln、Arg、Gly、Thr、Ala、Gaba、Pro、Lys、Tyr、Trp和总游离氨基酸。
同一省份由于局部的气候、生态条件不同,长期以来形成了同一省份不同香型的烤烟种植格局,为此对同一省份不同香型烤烟中游离氨基酸的含量进行了考察。将产自湖南省郴州桂阳和永州江华的浓香型烤烟和张家界桑植的中间香型烤烟分成两组进 间香型)烤烟的游离氨基酸含量高于郴州桂阳和永州江华(浓香型), 20个游离氨基酸含量在两组间均有显著性差异。郴州桂阳和永州江华(浓香型)烤烟中游离氨基酸含量明显低于表2中全国烤烟的平均水平,张家界桑植(中间香型)烤烟游离氨基酸含量高于表2中间香型产区的均值。
采用UPLC-SQD柱前衍生法定量分析了全国主要产区烤烟中的20种游离氨基酸,方法表征结果显示UPLC-SQD柱前衍生法适合烤烟中游离氨基酸的分析。烤烟样本中游离氨基酸的分析结果表明,烤烟的游离氨基酸含量在产地间差异较大;3种典型香型烤烟中浓香型烤烟游离氨基酸含量的RSD较其他两种香型大,氨基酸总量为浓香型＞清香型＞中间香型。对浓香型不同产地的游离氨基酸研究结果显示,黄淮产区烤烟游离氨基酸含量显著高于东南产区和长江中上游产区。对清香型不同产地的游离氨基酸研究结果显示,西南产区和东南产区(福建)的清香型烤烟的游离氨基酸有显著性差异,西南产区清香型烤烟大部分游离氨基酸和总游离氨基酸含量较东南产区(福建)高。对同一省份不同香型产地的游离氨基酸研究结果显示,湖南浓香型和中间香型烤烟游离氨基酸含量有显著性差异,湖南浓香型烤烟游离氨基酸的含量较中间型低,且明显低于所测全国主要烤烟产区的平均水平。
2013, Vol. 31 Issue (12): 1182-1188
PDF (907KB)
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