原位分析、在线分析等过程分析方法在过程动力学和实际生产监测中的需求日益提升[ 1 ]。而色谱法作为复杂体系的分析手段,其样品预处理和分离的时效性差的缺点使其在过程分析中的应用受到限制。乙酰丙酸是一种新型绿色平台化合物,是废木料等生物质资源液化的主要目标产物，目前测定它及其衍生物的方法有气相色谱法(GC)[ 2 ]、高效液相色谱法(HPLC)[ 3 ]和薄层色谱(TLC)扫描法[ 4 ]等。HPLC和GC能精确分析出产物的各种组分,但对设备要求高、预处理繁琐、分析时间长、成本较高,并非理想的过程分析手段。传统的薄层色谱法具有预处理简单的优势,但多采用单波长或者双波长扫描,采集的信息量小;借助数字图像分析技术对薄层色谱图进行定性、定量分析[ 5 ],使采集的信息量得到提升;但是薄层色谱方法仍然存在展开随机性大、定量准确度不高的问题,且展开的时效性问题也使得薄层色谱方法无法很好地适应过程分析的需要。因此寻求一种简单、快捷、可用于过程动力学研究的定量分析方法具有重要意义。
我们在前期工作[ 6 ]中以混合染料体系为对象,提出了基于斜投影的不展开薄层色谱法(non-development thin layer chromatography, NDTLC)对双组分体系的定量方法,实现了准确、快速、简单、重现性好的测定。本文进一步开展了对废木料液化复杂体系分析的研究,以液化产物中的乙酰丙酸为对象进行过程分析。对液化过程间歇取样点板,仅对液化过程终点的样本点用展开剂展开,扫描获取系列光谱,并将该光谱分为产物光谱和背景光谱两类;以两类光谱为基础,采用斜投影方法,从其余未展开的液化过程样本点扫描得到的混合光谱中分离出其中的乙酰丙酸纯光谱,实现直接定量,建立了复杂混合体系的不展开薄层色谱分析方法,监测了废木料液化过程的乙酰丙酸含量随时间的变化情况。同时将该分析结果与HPLC的结果进行对比,结果表明两种方法具有良好的一致性。
低维空间中包含彼此独立的子空间。斜投影是一种非正交投影算法,即沿着彼此非正交的子空间方向“斜”投影,将整体空间中所包含的信号完整地切割到彼此独立的两个子空间内[ 7 ]。
以数据空间来描述多变量体系,将数据空间 M 划分为被测变量的向量张成的子空间 S 和其余变量向量张成的相邻子空间 H ,那么:
S和H 之间互为核关系,据此建立纯信号分离模型。
用于分离光谱信号的模型称为斜投影算子ES|H:
利用斜投影算子将S从M 中分离出来[ 8 ],计算得到被测组分的含量。
本研究采用K-M(Kubelka-Munk)函数[9 ]描述反射吸收的强度,以每个波长下的K/S(K为被测物体的吸收系数,S为被测物体的散射系数)累加值作为定量指标。将样本扫描采集的光强形式的光谱数据转换成K-M函数形式的数据(记为KM),对每个波长下的KM值求和,得到SKM值。
具体的分析过程分为乙酰丙酸标准曲线的绘制、被测组分光谱数据 S和背景光谱数据H 的获取、待测样本的光谱数据获取和混合样本中乙酰丙酸含量的计算。
分别对不同点样量的斑点扫描,对每个波长下的KM值求和得到SKM值,作标准曲线y=ax+b(其中x为点样量,y为SKM值,a和b为常数)。
(1)将液化过程终点所取样品和被测组分标准品点样于薄层板上并经展开剂展开,分别对液化产物和被测组分标准品的薄层色谱展开轨迹进行多波长薄层扫描,得到薄层色谱分离特征图。
(2)依图将对应的液化产物系列光谱分为产物(乙酰丙酸)光谱(存为 W )和不含乙酰丙酸的其他物质光谱(存为背景光谱 Z )。
(3)采用系统独立变量数判断方法[ 10 ]确定Z的主成分数n。
(4)选取 W 中信噪比最好的n列作为计算用的产物光谱数据 S 。
(5)为降低计算强度,对 Z 做主成分分析(PCA)降维[ 11 ]。 Z 降维后的前n维作为背景光谱 H 。
(6)将 S 和 H 带入式(2)和式(3),求得斜投影算子 ES|H 。
将液化过程中所取样品点样于薄层板上,不经展开直接进行多波长薄层扫描,扫描采集的数据经数据转换后得到混合光谱数据,以 SAMP 表示。
以 PS 表示样本中乙酰丙酸的纯光谱信号,有:
计算 PS 的总和即SKM值。将SKM值代入标准曲线方程中,定量计算乙酰丙酸。
光纤光谱仪(Maya 2000Pro)和光纤反射探头(R200-ANGLE-UV)(Ocean Optics公司),氘灯光源(DH-2000UV-VIS-NIR, Mikropack公司),电动平移台(Sc101,北京光学仪器厂),高效液相色谱仪(Agilent 1200 Series, Agilent公司),电子分析天平(AR124CN,奥豪斯仪器(上海)有限公司)。
乙酰丙酸、碳酸氢钠、乙酸乙酯、甲醇均为分析纯。硅胶薄层板(50 mm×100 mm,安徽良臣硅源材料有限公司)。废木屑(40～120目)。
由电动平移台、光纤反射探头、氘灯光源和光纤光谱仪组成多波长薄层扫描平台,将薄层板置于电动平移台上[ 12 ]。反射探头与薄层板的距离为2 mm,设置光谱积分时间50 ms,平均次数为6,扫描积分时间间隔300 ms,扫描速度200 step/s,扫描波长范围190～1100 nm。根据斑点大小和扫描速度设置斑点扫描时间,记录该时间下斑点所对应的光度响应值。
C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μ m),以pH 2.6的磷酸-磷酸二氢钠溶液作为缓冲溶液，以缓冲溶液-乙腈(85 ∶ 15, v/v)作流动相,流速1.0 mL/min,柱温30 ℃,检测波长210 nm。
精确称量乙酰丙酸0.10 g,用水溶解并定容于100 mL容量瓶中,配制成质量浓度为1.00 g/L 的母液,依次稀释成质量浓度分别为0.10、0.40、0.60、0.80和1.00 g/L 的标准溶液。用微量进样器分别移取不同质量浓度的标准溶液各20 μ L点样于薄层板上,对点样斑点进行多波长薄层扫描;将样品扫描采集的光强形式的光谱数据转换成K-M函数形式数据,对每个波长下的KM值求和,得到SKM值。对点样量和SKM值作标准曲线。
将废木屑于80 ℃下干燥2 h,经粉碎机粉碎至40～120目。称取2.0 g木屑于三颈烧瓶中,按液固比50 mL ∶ 1 g加入6.3 mol/L 盐酸100 mL和5.4 g催化剂三氯化铁,在103 ℃下磁力搅拌反应6.5 h。每隔30 min取一次样品,用0.45 μ m超滤膜过滤后备用。分别用HPLC和多波长薄层色谱扫描结合斜投影算法测定不同液化时间下液化产物中乙酰丙酸的含量。
分别取0.60、0.80、1.00 g/L 的乙酰丙酸标准溶液20 μ L点样于同一薄层板上,点样量分别为12、16、20 μ g,每个斑点扫描5次,计算出斑点的SKM,其相对标准偏差(RSD)分别为0.78% 、0.86% 、0.70% ,均小于1.00% ,说明精密度较好。
取1.00 g/L 的乙酰丙酸标准溶液20 μ L,于薄层板上点样,每隔30 min对斑点进行多波长薄层色谱扫描,计算斑点的SKM分别为599、603、611、608、605,其RSD为4.61% ,表明乙酰丙酸点样于薄层板上的稳定性较好。
2.4节的实验结果表明,在2～20 μ g点样量范围内,乙酰丙酸的标准曲线方程为y=30.445x-2.1276,线性相关系数r为 0.9988。基于斜率和标准偏差计算得到本方法对乙酰丙酸的定量限为1.34 μ g。
分别取液化反应6.0 h的液化产物和1.00 g/L 乙酰丙酸标准溶液20 μ L点样于薄层板上,上行展开15 min,取出晾干,用多波长薄层色谱扫描仪扫描。展开剂为0.10 mol/L 碳酸氢钠溶液和乙酸乙酯(1 ∶ 1, v/v)混合均匀的上层溶液与甲醇按5 ∶ 1(体积比)混合。液化产物和乙酰丙酸标准溶液的薄层色谱分离特征图见图1和图2。对比两图,根据乙酰丙酸色谱峰的位置,将液化产物薄层色谱分离特征图中乙酰丙酸的相应位置数据选出作为光谱集 W ,不含 W 的其他光谱作为 Z 。
从液化产物薄层色谱分离特征图可以看出,废木料液化产物的组成较为复杂,获取的 Z 数据量大,因此在计算前需对 Z 做主成分分析进行降维处理,根据所选择的主成分数确定背景光谱数据以及被测组分光谱数据的维数。
选取主成分数最常用的方法是预测残差平方和(PRESS)法。该法需建立与已知数据尽可能一致的统计模型,而非从系统实际所包含的独立变量数为出发点考虑问题。本文采用文献[ 11 ]方法确定系统主成分数为5。按主成分数5对 Z 降维。
根据选取的主成分数,将 Z 降维成5维的背景光谱 H ,另外从光谱集 W 中选择出信噪比最好的5列作为产物光谱 S 。
将反应4.5 h和6.0 h的液化产物经超滤膜过滤,分别取20 μ L点样于薄层板上,不经展开直接扫描点样斑点,扫描采集的数据经数据格式转换为KM值,平行测量3次。同时采用HPLC法对样本进行平行分析。
应用斜投影算法从混合光谱中分离出乙酰丙酸光谱,图3为反应6 h的液化产物的多波长薄层色谱扫描光谱图,图4为应用斜投影算法从混合光谱中分离出的乙酰丙酸的光谱图。对分离的乙酰丙酸纯光谱定量,计算结果见表1。
从表1可以看出,所建立的斜投影算法结合不展开薄层色谱定量分析方法的测定结果与高效液相色谱法的测定结果无显著差异,最大相对误差为3.27% ,表明NDTLC分析结果稳定、可靠；因NDTLC方法前处理简单,不需要展开,显著简化了操作,故可替代HPLC进行定量分析。
在液化过程中每隔30 min取液化产物,用0.45 μ m超滤膜过滤,取20 μ L点样于硅胶板上,扫描得到系列混合样本光谱。依照数据分析流程对数据进行分析,从混合光谱中分离出不同反应时间液化产物乙酰丙酸的光谱数据并定量。
分别采用HPLC和斜投影-不展开薄层扫描法测定不同反应时间液化产物中乙酰丙酸的含量,结果见图5。
由图5可以看出，在0～210 min反应时间内乙酰丙酸的含量随着反应时间的增长而增高,在240～390 min反应时间内乙酰丙酸的含量变化趋向平坦;两种方法测得的液化过程中乙酰丙酸含量变化趋势相同,差异较小。应用斜投影-不展开薄层色谱法可快速监测液化过程,在一块薄层板上随取随点,待反应完成后一次扫描即可对全过程定量,极大地降低了分析工作量。
本文以废木料液化产物为研究对象,应用斜投 影-不展开薄层色谱定量分析方法对生物质液化产 物乙酰丙酸进行定量分析,并与传统的HPLC分析方法对比,结果在精密度和重现性方面都达到了HPLC相同水平。多波长薄层色谱扫描结合斜投影理论有效地提高了分析的准确度,且薄层色谱的优点得到了保留,使得薄层色谱应用于定量分析更加方便、快捷、节约成本。对于点样于薄层板上不易挥发且有光谱响应的组分都可以应用此方法进行定量分析,因此建立的斜投影-不展开薄层色谱定量分析方法适用于食品、化工、制药等多领域中混合物的定量分析、生产过程监控和产品质量控制等。
2014, Vol. 32 Issue (1): 100-104
PDF (1572KB)
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