肿瘤是严重威胁人类健康和导致我国居民死亡的首要疾病。肿瘤的原发病灶往往并不会直接导致死亡,多年的研究表明肿瘤患者的主要临床致死原因是肿瘤的侵袭和转移,肿瘤转移疾病所引起的死亡占实体瘤所致死亡的90%左右,因此肿瘤转移的早期准确检测就显得尤为重要[ 1, 2, 3 ]。循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)是指脱离原发肿瘤病灶,侵袭并进入淋巴管、血液等循环系统的肿瘤细胞。1896年,Ashworth等[ 4 ]在1例因癌症死亡的患者的外周血中发现了类似肿瘤细胞的细胞,并由此提出了CTCs的概念。循环系统中检测到CTCs提示可能有肿瘤微转移的存在并有进一步发展成为远处转移的可能性,因此对CTCs进行检测有助于肿瘤转移的早期诊断、肿瘤治疗效果评估、个体化治疗方案定制及肿瘤转移机制的研究。CTCs的检测具有可重复检测、取样简单、无创伤等优点[ 5, 6, 7 ],被称为液体活检(liquid biopsy),在近年来成为肿瘤早期检测研究的热点。
然而,循环系统中CTCs的含量极低,肿瘤转移患者每毫升全血中仅有1～10个CTCs[ 8, 9 ],因此要实现CTCs的检测对其进行分选富集是一个必不可少的步骤。CTCs分选富集效果的优劣将会直接影响其后续的检测(计数、基因扩增、基因测序等)效果,因此高纯度(分选富集后纯度高)、高灵敏性(不丢失CTCs)、高速、高细胞活性的CTCs分选富集是CTCs临床应用的重点和难点。
微流控技术(microfluidics)是一种在微米尺度的流道内对纳升或皮升量级的液体进行操纵或控制的技术,其具有低试剂样本消耗、快速、低成本、高通量、使用简便、可多部件组合等优点[ 10, 11 ]。许多研究团队利用微流控芯片进行了CTCs的分选富集研究,并成功地实现了快速、高回收率、高纯度的分选富集。
微流控芯片内CTCs的分选富集方法主要分为生物化学方法和物理方法两大类。生物化学方法指的是选择特异性抗体对细胞表面表达的标志物进行特异性的抗原抗体吸附,从而分选富集目的细胞。根据分选富集目的细胞的不同可分为阳性选择方法及阴性选择方法。物理方法指的是利用外力场(例如磁场、电场、流体场、超声波等)基于细胞间的物理特性差异(大小、变形性、密度、介电性等)进行分离。根据分选富集力的来源可将物理方法分为流体动力分选富集(hydrophoresis)、介电电泳分选富集(dielectrophoresis, DEP)、声动力分选富集(acoustophoresis)、磁场力分选富集(magnetophoresis, MAP)等,各种方法及优缺点见图1。
阳性选择方法是以CTCs作为目的细胞直接捕获CTCs。上皮细胞黏附分子(EpCAM)是最常使用的阳性选择CTCs的表面标志物,近年来也有许多基于新的标记物进行的特异性抗原抗体分选的研究[ 12 ]。生物化学方法分选富集效果的决定性因素是抗原抗体的接触程度,也就是细胞与结合了抗体的芯片表面的接触情况。最初,抗EpCAM抗体直接结合在微流控芯片管道内,未制作特别的芯片内结构;然而微流控芯片内的流体运动呈一种层流状态,只有靠近通道表面的一层流体内的细胞才有机会与抗体接触,而位于中间的细胞则不能与管道表面接触,这就使得抗原抗体接触较少,导致捕获效果不理想。Nagrath研究团队[ 13 ]随后制作了一种命名为CTC-Chip的微流控芯片(见图2),芯片内设计了许多结合了EpCAM抗体的微柱,实现了在流速为2 mL/h的条件下捕获细胞;由于微柱的比表面积高于平面通道,所以抗原抗体的接触更多,其捕获率可高达99% 。
为了进一步增加抗原抗体的接触,Stott研究团队[ 14 ]设计了一种命名为鱼骨结构(herringbone chip, HB-Chip)的微流控芯片,实现了从 人工配制的已知浓度的肿瘤细胞血液混合液中分选富集CTCs。该芯片在通道内设计了一种鱼骨结构,利用该结构产生的一种高度差而将原流体的层流状态转变为涡流状态,使得流体细胞更容易与结合了抗体的通道接触。
Wang研究团队[ 15 ]利用硅纳米(silicon-nanopillar, SiNP)进行抗体的结合,3D的纳米微柱具有更高的比表面积,可提供更多的抗原抗体接触机会,研究表明利用该结构进行捕获的捕获率为45% ～65% ,比只是在表面上结合抗体的捕获率(4% ～14% )高许多;与此同时,他们还设计了一种混匀通道的结构从而改变流体层流状态,实现了从全血中高特异性(95% )地分选富集MCF-7肿瘤细胞。微珠和磁珠的比表面积高于微柱,其作为抗体的结合载体被研究者应用于CTCs的抗原抗体特异性捕获。Kang研究团队[ 16 ]使用磁珠作为抗体的结合载体实现了从1 mL鼠全血中高回收率(90% )、高纯度(0.4%白细胞)、高活性(90% )的CTCs分选富集。CellSearch系统是目前商业化并唯一获得美国食品与药品监督管理局(FDA)认可的CTCs检测技术,该系统正是使用了免疫磁珠富集技术[ 17 ]。为了再进一步增加抗原抗体的接触,许多研究团队把以上的各种方法进行了结合。Lin研究团队[ 18 ]设计了混匀涡流管道并使用微珠作为抗EpCAM抗体的结合载体,把结合了抗体的微珠与样本通入混匀管道,在利用微珠高比表面积的同时也利用混匀涡流进一步增加抗原抗体的接触。
阳性选择方法是以CTCs表面特异性的标志物进行抗原抗体的特异性吸附,其最大的优点是特异性高。研究发现CTCs的产生主要有被动型与主动型两种。被动型CTCs是由外在的原因(穿刺、手术等)破坏了肿瘤原发灶把肿瘤细胞带入循环系统中,这种被动型CTCs在循环系统中容易死亡,由此产生的肿瘤转移较少,在肿瘤转移中的意义不大。主动型CTCs是肿瘤细胞主动性地发生上皮-间质转化(epithelial mesenchymal transition, EMT)从原发灶中脱离进入循环系统,这种转化产生的主动型CTCs在循环系统中更具有生命力,更易产生肿瘤转移。与被动型CTCs相比,主动型CTCs的细胞尺寸及表面标志物EpCAM的表达会降低(也有表达增高),因此阳性选择方法不能有效地分选富集更有意义的主动型CTCs[ 19 ]。
阴性选择方法是以除CTCs之外的细胞作为目的细胞进行特异性捕获,捕获后将其弃除,留下CTCs。在使用阴性选择方法分选富集CTCs时,先使用红细胞破碎液进行红细胞的破碎去除,然后在芯片内微结构表面结合CD45抗体(CD: cluster of differentiation),这可以去除血液中大多数的白细胞。阴性选择方法近年来得到了广泛的研究。Lustberg等[ 20 ]利用免疫磁珠的方法成功地在乳腺癌及头颈鳞癌患者的全血中吸附正常血细胞,从而去除正常血细胞,留下CTCs。与阳性选择方法相比,该方法不依赖CTCs表面标志物的表达。Huang等[ 21 ]首先选用阴性选择方法进行CTCs的初步分选富集,随后使用光诱导介电电泳(ODEP)的物理方法进行二次分选富集,成功地分选富集了CTCs,纯度为PC-3细胞74% ～82% , OEC-M1细胞64% ～66% ;细胞活性为PC-3细胞76% ～83% , OEC-M1细胞61% ～68% 。
阴性选择方法不以CTCs作为抗原抗体吸附对象,因此分选富集的CTCs细胞活性较阳性选择方法要高。与此同时,阴性选择方法所分选富集的CTCs种类较多,可以是多种肿瘤(乳腺癌、前列腺癌等)的CTCs,并且可以分选富集出更有意义的主动型CTCs。其不足是特异性较低。
微流控技术是一种对微量流体的控制技术,因此流体动力作为物理分选富集的外力来源在微流控芯片内并不是一种外力。基于细胞尺寸及细胞变形性等物理特性差异,利用流体动力进行分选富集主要可以分为过滤、惯性迁移(inertial migration)、确定性侧向位移(deterministic lateral displacement, DLD)等。
许多研究团队已经成功地在微流控芯片内整合过滤膜进行CTCs分选富集。Zheng研究团队[ 22 ]利用膜过滤滞留CTCs,并对其进行膜孔上的原位细胞裂解,随后进行聚合酶链反应(PCR)。该研究团队成员Lin等[ 23 ]将孔径为8 μ m的透明聚对二甲苯过滤膜嵌合于微流控芯片内,并进行了肿瘤患者外周血CTCs的分选富集,其回收率高达90% 。刘大渔研究团队[ 24 ]研究加工了一种封接多孔聚碳酸酯薄膜的微流控芯片,在流速500 μ L/min 下对Hela细胞的回收率可达85% 。膜过滤的不足之处是需要在微流控芯片中进行膜的嵌合,其不利于微流控芯片的键合及芯片之间的兼容。在芯片内制作孔洞、坝、堰等结构也可以作为过滤装置对细胞直径大于间隙的CTCs进行滞留。Mohamed研究团队[ 25 ]在微流控芯片内设计了栅栏过滤结构,其微柱间隙逐渐减低,从而实现在芯片不同部分分选富集不同大小的肿瘤细胞,利用该微流控芯片成功地从人全血中分选富集了8种肿瘤细胞。细胞不断滞留在过滤结构上可能发生芯片堵塞,其流体压力不断增大会影响细胞活性,如何在不损伤细胞活性的前提下把滞留细胞取出也是一个较为棘手的问题。Chung等[ 26 ]研究设计了一种新型改良坝结构过滤微流控芯片,该芯片成功地利用坝结构进行CTCs分选富集,并且避免了传统过滤芯片的堵塞问题,分选的CTCs细胞活性不受到损伤,并且可以直接在芯片内进行染色或是裂解细胞进行基因分析等后续操作。
微流控芯片内的流体呈层流状态,层流的流速呈现一种抛物线状分布,其剪切力也呈现一种梯度分布。这种剪切力梯度诱导产生的一种力会将悬浮在流体中的细胞推向管道壁,而管道壁也会产生一个反作用力将细胞推离管道壁,这两种力的合力被称为惯性迁移力。惯性迁移力的大小与细胞大小有关,不同大小的细胞在管道内所受的惯性迁移力大小不同,因此在管道内的分布位置也不同。利用惯性迁移力分选富集CTCs,按芯片结构不同可以分为直管道、弯管道、螺旋管道3种。Jung等[ 27, 28 ]设计制作了命名为MOFF(multiorifice flow fractionation)及MS-MOFF(multi-stage multi-orifice flow fractionation)的直管道惯性迁移力微流控芯片,利用该芯片成功快速(100～300 μ L/min)、高细胞活性(89% ～91% )地分选了CTCs。流体在弯管道中流动时,情况较直管道更为复杂,在流经管道转弯处时,管道内的流体不仅仅受到直管道中的惯性迁移力同时也会受到离心力,在弯管道中产生涡流,这种涡流会对流体中的细胞产生一种拽力(称为迪恩拽力)。已经有许多研究证明,在弯管道内进行的惯性迁移力分选富集较直管道具有更好的效果。Di Carlo研究团队[ 29, 30 ]利用弯道惯性迁移力对微粒及细胞进行分选富集,在1 mL/min 的高流速下实现了高纯度(90% ～100% )的分选富集。螺旋管道是弯管道的进一步发展,Kuntaegowdanahalli等[ 31 ]使用螺旋管道惯性迁移力进行了直径分别为10、15、20 μ m聚苯乙烯微粒的分选,其分选效率可达90% ;对肿瘤细胞进行分选的效率也可达80% ,细胞活性可达90% ,通量高达106 cells/min。Sun等[ 32 ]利用双螺旋管道惯性迁移力实现了回收率为96.77% 、细胞活性为88.5% 、通量为3.33×107 cells/min的全血细胞中MCF-7及Hela细胞的分选富集。
DLD是近年来新出现的物理分选富集方法,其原理是设计特定尺寸的DLD微柱阵列,在DLD微柱阵列中,大于临界半径的大物质与微柱阵列碰撞后发生侧向位移,向一侧汇聚;而小于临界半径的小物质在与微柱阵列碰撞后并不发生侧移,按照其原流向流过阵列。基于CTCs细胞尺寸(15～25 μ m)与血细胞尺寸(5～15 μ m)差异的物理特性,可设计制作分选富集临界半径介于CTCs与血细胞间的DLD阵列微流控芯片。CTCs(大于临界半径的大物质)与微柱阵列碰撞后向一侧汇聚,而血细胞(小于临界半径的小物质)碰撞后并不发生侧移,保持流体原有流向流过阵列,从而实现CTCs的分选富集。利用DLD进行CTCs分选富集是近年来的研究热点[ 33, 34 ]。Loutherback等[ 35 ]利用DLD阵列实现了外周血肿瘤细胞的快速(10 mL/min)、高回收率(85% )分选富集。Liu等[ 36 ]利用三角形微柱DLD阵列微流控芯片(见图3)在流速 2000 μ L/min 下实现回收率达95%的外周血肿瘤细胞的分选富集,并探讨了细胞大小、微柱结构、流速之间的关系。
DEP分选富集是指在微流控芯片外加一个不均一的电场对介电特性不同的细胞进行迁移分离。DEP分选富集CTCs具有很高的特异性,并且分选的细胞能保持非常高的细胞活性[ 37 ]。Becker等[ 38 ]使用交叉性微电极阵列芯片成功利用介电电泳进行了人类癌细胞与血细胞之间的分选,随后在该芯片内从人全血中分选出了人白血病细胞(HL-60)及乳腺癌细胞(MDA-231),分选速度为103 cells/s。DEP分选富集虽具有很高的特异性,但是却很少应用于临床样本分析,主要原因是DEP分选富集通量较小,是一个较为耗时的过程。因此DEP分选富集常常与其他分选富集技术相结合,利用其他分选技术的高通量特性实现初筛选,DEP分选富集作为特异性更高的二次分选富集。Jung等[ 39 ]设计制作了一种MOFF与DEP结合的CTCs分选富集微流控芯片,首先使用MOFF流体动力分选富集方法高通量、快速地从外周血中初筛MCF-7乳腺肿瘤细胞,随后进行DEP的二次分选富集,最终实现了快速(126 μ L/min)、高纯度(99.24%红细胞、94.23%白细胞被去除)的CTCs分选富集。
MAP分选富集是在微流控芯片外加入一个磁场对自身磁性不同的细胞进行分选富集;也可以利用抗原抗体吸附的生物化学方法把细胞捕获在磁珠上,然后对磁珠进行分选富集。Han研究团队[ 40 ]设计制作了一种MAP分选富集微流控芯片,基于红细胞与白细胞自身磁性不同对两者成功分选。然而,细胞之间的磁性特性差异并不是非常的明显,利用磁场外力对细胞直接分选富集在纯度上也不是非常的理想。Han研究团队随后把MAP与抗原抗体吸附的生物化学方法进行结合,既利用了生物化学方法特异性高的优点,又利用了MAP简化芯片结构的优点,其分选CTCs的纯度高达97% ,敏感性高达90% ,速度可达5 mL/h。
声动力分选富集是在微流控芯片外加一个超声波场,由于细胞大小、形状等特性不同,其在超声波场中产生共振所需的超声波频率也不同,采用不同的超声波频率能引起不同细胞的共振迁移,从而达到分选不同细胞的目的。Thomas等[ 41 ]采用声动力分选富集的物理方法先成功地从7 μ m微球中分选出5 μ m大小的微球(纯度高达99% ),随后利用该微流控芯片从志愿者全血中分选富集前列腺癌细胞,其分选的纯度(97.4% ～98.4% )和细胞活性(93.6% ～97.9% )都较高。
循环肿瘤细胞在肿瘤转移监测、肿瘤治疗效果评价等方面具有很广泛的潜在应用价值,然而血液中循环肿瘤细胞的浓度极低,因此对其进行分选富集是一个必不可少的过程。微流控芯片技术的出现给循环肿瘤细胞的分选富集提供了一个具有多方面优势的平台。在微流控芯片上进行分选富集的方法较多，各个方法皆有其优缺点，因此其应用性也不同。
生物化学方法是基于抗原抗体的特异性吸附进行分选富集,其最大的优点是高特异性。其缺点主要有:由于抗原抗体的吸附作用不能在较高流速下进行,因此限制了其流速,从而较为耗时,通量低;抗原抗体反应会影响细胞活性;细胞表面的抗原(表面标志物)表达不确定性;抗体试剂价格较为高昂。物理方法是基于细胞的物理特性(大小、变形性、密度、介电特性、磁性等)在外加力的作用下进行分选富集,其优点是不需要生物化学方法的抗原抗体吸附,从而节省了抗体等较为昂贵试剂的成本;分选富集后的细胞活性较高;分选速度较快。不足之处主要是:相对生物化学方法,其特异性不够高;外加力设备增加了制作难度与制作成本(流体动力物理分选方法除外)。
综上所述,我们认为,由于生物化学方法本身的不足使得其很难成为大样本量的首选方法,因此不考虑作为初筛方法。物理方法具有可快速分选富集等优势,可作为大样本量的初筛方法,然而其分选的纯度及特异性较低,因此需要与特异性高的分选富集方法相结合。值得注意的是,物理方法中的介电电泳方法具有较高的特异性,而流体动力学方法不需要外加设备,这两种物理方法由于各自具有的特殊优点正成为研究热点。具体采用何种方法进行分选富集CTCs,应该充分考虑所分选的CTCs情况(特异性物质表达情况)、分选主要目的(快速初筛或二次筛选)、芯片设计情况(成本控制及复杂程度)。例如,如果所分选富集的CTCs表面的EpCAM表达降低或表达情况不明,则需要考虑选择阴性选择方法或采用物理方法进行分选富集。如果是进行初次筛选,则可考虑采用速度较快的物理方法进行初筛,在下游可结合特异性较高的生物化学方法进行二次分选富集。本研究团队[ 42 ]利用多通道确定性侧向位移方法,在上游实现了CTCs的快速初筛;在下游利用鱼骨结构芯片实现抗原抗体的特异性吸附,实现二次筛选。
在后续的研究工作中,对CTCs表面特异性物质的研究及采用多种分选富集方法相结合,充分利用各种分选富集方法的优点,根据自身设计的芯片要求,取长补短设计芯片是将来的研究趋势。
Wang研究团队[ 15 ]利用硅纳米(silicon-nanopillar ...
2014, Vol. 32 Issue (1): 7-12
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