色谱  2013, Vol. 31 Issue (12): 1176-1181   PDF (882KB)    
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曾玉珠
章勇
董良飞
张蓓蓓
赵永刚
固相萃取-超高效液相色谱-三重四极杆质谱法同时测定不同水体中的6种雌激素
曾玉珠1,2, 章勇2, 董良飞1, 张蓓蓓2, 赵永刚2     
1. 常州大学环境与安全工程学院, 江苏 常州 213164;
2. 江苏省环境监测中心, 江苏 南京 210036
收稿日期：2013-8-13
基金项目：江苏省环保科研项目（201128）
通讯作者：赵永刚, E-mail: 13770788711@163.com
摘要：建立了固相萃取-超高效液相色谱-三重四极杆质谱（SPE-UPLC-MS/MS）联用技术同时测定不同水体中6种雌激素（雌三醇、17-β-雌二醇、17- α-雌二醇、雌酮、炔雌醇、己烯雌酚）的分析方法。样品经HLB固相萃取柱提取和净化后经BEH C18色谱柱分离，采用MS/MS多反应监测模式（MRM）进行分析。采用内标法定量，以雌三醇-D3、17-β-雌二醇-D2、己烯雌酚-D8为内标。当6种雌激素的质量浓度在1.0~100 μg/L线性范围内时，所得回归方程的相关系数（r）均不小于0.9982；方法检出限为0.27~0.45 ng/L，定量限为1.08~1.78 ng/L；在高、中、低3个添加水平下的回收率为68.3%~97.4%，相对标准偏差（RSD）小于15%。该方法灵敏、准确，检测范围广，分析速度快，适用于地表水、废水、饮用水源水及生活用水等不同水体中6种雌激素的同时检测。
关键词： 固相萃取     超高效液相色谱-串联质谱     雌激素     水体    
Simultaneous determination of six estrogens in different water bodies by solid phase extraction and ultra performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry
ZENG Yuzhu1,2, ZHANG Yong2, DONG Liangfei1, ZHANG Beibei2, ZHAO Yonggang2     
1. School of Environmental and Safety Engineering, Changzhou University, Changzhou 213164, China;
2. Jiangsu Environmental Monitoring Center, Nanjing 210036, China
Received: 2013-8-13
Abstract: A method has been developed for the simultaneous determination of six estrogens (estriol, 17-β-estradiol, 17-α-estradiol, estrone, ethinyloestradiol, diethylstilbestrol) in water environment by solid phase extraction and ultra performance liquid chromatography couple with triple quadrupole mass spectrometry. After enriched and purified by an HLB solid phase extraction column, the six estrogens were separated by a BEH C18 column and then determined by MS/MS with multiple reaction monitoring (MRM) mode. The quantification was achieved by internal standard method, with estriol-D3, estradiol-D2 and diethylstilbestrol-D8 as the internal standards. Good linear relationships were obtained in the mass concentration range of 1.0-100 μg/L with high correlation coefficients over 0.9982. The limits of detection and quantification for the six estrogens were 0.27-0.45 ng/L and 1.08-1.78 ng/L, respectively. The recoveries were in the range of 68.3%-97.4% at the three spiked levels and with the relative standard deviations below 15%. The method shows high sensitivity, good precision, extensive analytical range and high analytical speed. It was successfully applied to the simultaneous detection of the six estrogens in four different water bodies including surface water, waste water, source water of drinking and domestic water.
Key words: solid phase extraction (SPE)     ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS)     estrogens     water bodies    

雌激素是一类新型环境激素类污染物,具有类固醇化合物生物活性,进入机体后可干扰内分泌系统的正常调控功能,影响人类健康和物种繁衍[ 1, 2 ]。近年来,雌激素的环境污染及危害问题已引起世界范围内的关注[ 3 ]。环境中存在的雌激素有雌酮(E1)、17- α -雌二醇(17- α -E2)、17- β -雌二醇(17- β -E2)、雌三醇(E3)、己烯雌酚(DES)及17- α -炔雌醇(EE2)等[ 4, 5 ]。其中E1、17- α -E2、17- β -E2、E3是天然雌激素,E1和E3是E2的代谢产物,E2的活性最强,可通过生物体代谢释放到环境中;EE2、DES是人工合成的雌激素,是口服避孕药、畜牧养殖及绝经综合征等用药的主要成分。随着雌激素使用激增,大量雌激素被排放到水环境中,通过水生生物的食物链富集,危害生态安全和人类健康。因此,有必要建立一个敏感、快速、准确的方法分析水环境中的雌激素,这对环境健康评估和生态评价都具有重要的现实意义。

目前,国内外雌激素的检测方法有气相色谱(GC)[ 6 ]、液相色谱(LC)[ 7 ]及其与质谱(MS)的联用[ 8, 9, 10, 11, 12, 13 ]技术等。由于雌激素具有弱极性或中等极性,熔点均高于170 ℃,不易气化,因此采用GC或GC-MS技术时必须先将其衍生化成易挥发的化合物;但衍生过程繁琐,耗费时间,而且衍生物需要马上测定,影响测定结果的精确性和重现性[ 14 ]。相比之下,LC及LC-MS/MS技术不需要衍生,操作简单,具有灵敏度高、易排除杂质干扰等特点,常用于环境中雌激素的检测。Zhang等[ 15 ]建立了废水中雌激素的液相色谱-质谱分析方法;Liu等[ 16 ]建立了地表水/废水中雌激素的液相色谱-质谱分析方法;Hu等[ 17 ]建立了饮用水源水中雌二醇的液相色谱-紫外检测法。但目前对于不同水体基质中多种雌激素同时检测的分析方法研究甚少。

本文采用HLB固相萃取柱进行样品前处理,建立了UPLC-MS/MS同时分析不同水体(地表水、废水、饮用水源水及生活用水)中6种雌激素(E1、17- α -E2、17- β -E2、E3、DES及EE2)的分析方法。采用内标法定量,以雌三醇-D3(E3-D3)、17- β -雌二醇-D2(17- β -E2-D2)、己烯雌酚-D8(DES-D8)为内标。对主要技术参数进行了优化,同时将该方法应用于南京不同水体中6种雌激素的检测,为进一步研究雌激素在水环境中的迁移、转化提供了基础。



1 实验部分
1.1 仪器与试剂

ACQUITYTMUPLC-TQ Detector质谱仪(美国Waters公司); Milli-Q超纯水器和0.22 μ m孔径滤膜(PVDF,美国Millipore公司); TurboVap II氮吹仪(Zymark公司); 12通道固相萃取装置(美国Supelco公司); Waters Oasis HLB固相萃取柱(500 mg, 6 mL,美国Waters公司)。

雌激素及同位素内标物标准品:E3(99.5% )、17- α -E2(99.0% )、17- β -E2(97.5% )、EE2(99.0% )、E1(99.5% )、DES(99.5% )、E3-D3(98.0% )、17- β -E2-D2(98.0% )、DES-D8(98.0% ),德国Dr. Ehrenstorfer公司。乙腈、甲醇、丙酮、乙酸乙酯均为HPLC级(德国Merck公司)。

1.2 标准溶液的配制

准确称取6种雌激素各10 mg,用甲醇配成 1000 mg/L 的储备液,用前根据需要用50%(如无特殊说明均为体积分数)的甲醇水溶液稀释成不同浓度的混合标准工作液;用甲醇配制2.0 mg/L 雌三醇-D3、2.0 mg/L 17- β -雌三醇-D2和1.0 mg/L 己烯雌酚-D8混合内标工作液,均于4 ℃冰箱中保存。

1.3 样品的采集和预处理

水样取自南京地区的4种不同水体(地表水、废水、饮用水源水和生活污水),棕色瓶保存,用盐酸调节水样pH至3.0以保护水样,避免微生物降解。预处理之前置于4 ℃冰箱中避光保存。

取500 mL水样,经玻璃纤维滤纸(孔径0.45 μ m)过滤后通过HLB固相萃取柱进行富集净化。上样前,HLB柱依次用6 mL的丙酮、甲醇、pH 3的盐酸溶液活化平衡;上样速率为3～5 min/mL;上样结束后,用6 mL 20%甲醇水溶液淋洗净化小柱,常温条件下氮气吹干;最后用8 mL丙酮洗脱。洗脱液经氮气吹至约0.10 mL,然后用50%甲醇水溶液定容至1 mL,再加入10 μ L的同位素内标混合工作液,过0.22 μ m滤膜后进行UPLC-MS/MS测定。

1.4 色谱-质谱条件

液相色谱条件:Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱(5 mm×2.1 mm, 1.7 μ m);柱温40 ℃;进样量10 μ L;流动相流速0.3 mL/min;流动相A为0.1%氨水,B为甲醇。洗脱梯度:0～2.0 min, 50%B～60%B; 2.0～4.2 min, 60%B～95%B; 4.2～5.0 min, 95%B～50%B。

质谱条件:电喷雾负离子源(ESI-)模式;离子源温度为120 ℃;毛细管电压为-2.8 kV;脱溶剂温度为450 ℃;脱溶剂气和锥孔气为氮气,脱溶剂气流速为850 L/h,锥孔气流速为50 L/h;碰撞气为氩气;多反应监测模式(MRM)。表l为雌激素及同位素内标物的UPLC-MS/MS分析参数。

表1 雌激素与同位素内标物的UPLC-MS/MS分析参数 Table 1 Parameters for UPLC-MS/MS analysis of estrogens and isotope internal standards

2 结果与讨论
2.1 质谱条件的优化

本实验采用ESI源,雌激素和同位素内标物在正离子和负离子模式下进行全扫描,选择各物质的分子离子峰和电离方式。结果表明,在负离子模式下可获得较高丰度的母离子[M-H]-。优化锥孔电压(CV)值之后,对二级质谱碰撞气能量(CE)进行优化,使特征离子的强度达到最大,确定定量离子和定性离子,以达到最佳的质谱检测。

2.2 色谱条件的优化

本实验选择Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱,比较了相同的仪器条件下以甲醇或乙腈为流动相时6种雌激素的检测灵敏度(以信噪比计)。结果表明,对所有雌激素而言,使用甲醇比乙腈所得的灵敏度高一倍,因此选择甲醇作为流动相。

使用ESI源分析时,在流动相中加入适当的盐或调节pH值通常可改变分析物的电离情况。考察了在流动相中加入不同浓度的醋酸铵和不同体积分数的氨水对UPLC-MS/MS分析6种雌激素灵敏度的影响。以甲醇/水作为流动相时6种雌激素的响应为基准,发现在水相中加入不同浓度的醋酸铵时,大部分目标物响应削减30.0% ～80.0% ;而在水相中加入不同体积分数(0.1% 、0.2% 、0.5% )的氨水时,除DES波动较小外,其他分析物的灵敏度先提高后降低;以甲醇/0.1%氨水作为流动相时,各分析物的灵敏度最高。比较甲醇/水和甲醇/0.1%氨水作为流动相时分析物的总离子流图(见图1),发现甲醇/0.1%氨水作为流动相时的色谱峰峰形和分离度更好。综上所述,选择甲醇/0.1%氨水作为流动相有利于目标物的离子化和分离。

图1 6种雌激素混合标准溶液的总离子流图 Fig.1 Total ion chromatograms for mixed six estrogen standard solution Mobile phases: a. methanol/0.1% ammonia solution; b. methanol/water.

2.3 SPE条件的优化
2.3.1 洗脱剂和淋洗溶剂的选择

洗脱剂是影响萃取效率的重要因素。如图2所示，比较了4种不同极性的溶剂(甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯)的洗脱效果。使用甲醇和丙酮时各雌激素的回收率较高,在75%以上;而使用乙腈和乙酸乙酯时部分雌激素的回收率较低,如E3和DES在45%以下。考虑到用丙酮作为洗脱剂时的浓缩时间比甲醇短,因此选择丙酮作为洗脱溶剂。

水样基质比较复杂,因此有必要在洗脱之前对HLB柱进行淋洗。考察了6 mL不同体积分数(0、10% 、20% 、30% 、40% 、50% )的甲醇水溶液对雌激素萃取效率的影响。从图3可以看出,除E3外的5种雌激素在HLB柱上的保留较强,即使用50%甲醇水溶液淋洗仍不能洗脱下来;而E3在甲醇含量大于20%时即开始被洗脱下来。因此选择用6 mL 20%甲醇水溶液为淋洗溶剂。

图2 不同洗脱溶剂对雌激素回收率的影响 Fig.2 Effect of elution solvent on the recoveries of estrogens

图3 淋洗溶剂中甲醇含量对雌激素回收率的影响 Fig.3 Effect of the methanol content in washing solution on the recoveries of estrogens

2.3.2 水样pH值对回收率的影响

用盐酸和氨水调节水样pH为3.0、7.0及11.0,考察不同pH值对雌激素萃取回收率的影响。结果表明,pH值的变化对回收率的影响不大,不同pH值条件下的回收率都达到75%以上。由于pH 3.0时,大多数雌激素的回收率略高于pH 7.0或11.0,因此确定水样最佳pH为3.0。

2.4 线性关系、方法的检出限和定量限

用50%甲醇水溶液配制1.0、2.0、5.0、10、20、50和100 μ g/L 的雌激素混合标准溶液1 mL置于进样瓶中,各加入10 μ L 2.0 mg/L 的雌三醇-D3、2.0 mg/L 17- β -雌三醇-D2和1.0 mg/L 己烯雌酚-D8混合内标液,混匀。以待测物与内标物定量离子的峰面积比(Y)对待测物的质量浓度(X, μ g/L)进行线性回归,得到线性方程(见表2)。6种雌激素在1.0～100 μ g/L 的质量浓度范围内呈良好的线性关系,相关系数(r)均大于 0.9982。图4为100 μ g/L 雌激素标准溶液的MRM色谱图,表明本方法可在5 min内实现6种雌激素的同时快速检测。

对500 mL空白加标水样(0.5 μ g/L)进行测定,重复7次,按3.143倍标准偏差计算方法检出限(LOD),以4倍LOD作为定量限(LOQ)[ 18 ],结果见表2。

表2 6种雌激素的线性范围、线性方程、相关系数、 检出限和定量限(n=7) Table 2 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients (r), limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) of the six estrogens (n=7)

2.5 方法的回收率及精密度

选择4种不同水体,配制低(5 μ g/L)、中(10 μ g/L)、高(50 μ g/L)3个水平的加标水样进行方法的回收率和精密度试验。测定结果扣除水样本底后,计算得到的方法回收率和相对标准偏差如表3所示,6种雌激素的平均回收率为68.3% ～97.4% ,相对标准偏差(RSD)小于15% 。因此,所建立的方法具有较好的准确度和精密度,满足分析要求。

2.6 实际样品分析

用所建立的方法对南京市4种水体包括地表水、废水、饮用水水源及生活用水等进行了测定。结果表明,地表水、废水及生活用水中都含有不同浓度的雌激素,含量在ng/L水平,对水体中的生物有一定的危害,应引起高度关注。

2.7 不同分析方法所得结果比较

比较了不同检测方法测定水环境中雌激素的结果。由表4可见,若采用GC-MS法,在样品前处理过程中必须进行衍生化,操作繁琐,耗时长,所以GC-MS的实际应用受到一定的限制;而HPLC、HPLC-MS/MS法具有一定的普遍性,但很难排除基质干扰,检出限较高,总体来说灵敏度较低;本实验建立的SPE-UPLC-MS/MS检测方法,操作简便,分析速度快,检出限较低,回收率较高,专属性强,适用于不同水体中较低浓度雌激素的检测。

图4 6种雌激素混合标准溶液(100 μ g/L)的多反应监测模式色谱图 Fig.4 Multiple reaction monitoring (MRM) chromatograms of mixed six estrogen standard solution (100 μ g/L)

表3 4种水体中雌激素的加标回收率及相对标准偏差(n=6) Table 3 Spiked recoveries and relative standard deviations (RSDs) of estrogens in four kinds of water bodies (n=6)

表4 不同检测方法的比较 Table 4 Comparison between different detection methods

3 结论

本文建立了采用SPE-UPLC-MS/MS测定4种水体中6种痕量雌激素的方法。该方法具有高的灵敏度、精密度和回收率,而且具有检测范围广、分析时间短等优点,是一种高效、快速、可靠的适于不同实际水样中雌激素检测的分析方法。

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