二氯二甲吡啶酚、磺胺类药物(SAs)、沙星类药物(QNs)等是家禽养殖中常用的几种药物,分别具有抗菌、抗支原体、抗球虫等作用,常用来治疗或预防鸡的细菌、支原体和球虫感染。家禽饲养过程中,不合理用药易导致动物体内药物残留超标,并通过食物链的传递,给人类的生命安全带来隐患。许多国家对鸡肉中这几类药物的最高残留限量(MRL)都做了规定,例如美国及我国对鸡肉中二氯二甲吡啶酚的MRL要求均为5 mg/kg[ 1 ],而欧盟和日本则禁用二氯二甲吡啶酚[ 2 ];欧盟和日本对禽肉中沙星类药物的MRL规定在0.02～0.10 mg/kg 之间,磺胺类药物的MRL在0.05～0.10 mg/kg 之间[ 1 ];这其中以日本“肯定列表”最为详尽和严格。随着人们对食品安全的日益重视,禽肉产品中药物残留的限量要求也日益严格。检验项目的不断增多和MRL值的不断降低,对相关检测手段提出了新的要求和挑战。
目前测定动物源性食品中二氯二甲吡啶酚残留的方法主要有气相色谱(GC)法[ 3 ]、气相色谱-质谱(GC-MS)法[ 4 ]、气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)法[ 5 ]、高效液相色谱(HPLC)法[ 6 ]和液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法[ 7, 8 ]等。测定SAs及QNs主要使用HPLC[ 9, 10, 11, 12, 13 ]和LC-MS/MS法[ 14, 15, 16, 17, 18, 19 ]。GC及GC-MS法虽然灵敏度较高,但需要对样品进行衍生化后再进样分析,方法烦琐,干扰多,适用范围有限。HPLC法多使用紫外或者荧光检测器,易被杂质干扰,对样品前处理和色谱分离条件都提出了更高的要求;另外由于紫外检测器灵敏度低,难以满足一些药物残留限量的要求。而LC-MS/MS灵敏度高、抗干扰能力强,更适用于多残留检测。鸡肉中药物残留分析的前处理多采用乙腈、甲醇等纯有机溶剂或磷酸盐等缓冲溶液提取,正己烷液液分配除油,经氧化铝、离子交换、HLB等固相萃取柱净化等步骤。如杨雯筌等[ 8 ]采用甲醇提取鸡肉中的二氯二甲吡啶酚,经正己烷液液分配除油,LC-18串联阴离子交换固相萃取柱净化;林保银等[ 10 ]采用乙腈提取鸡肉中的QNs,之后加入磷酸盐缓冲液过Strata-X聚合物反相固相萃取小柱进行净化;曹慧等[ 17 ]采用Na2EDTA-Mcllvaine-乙腈混合溶液提取畜禽肉中的SAs及QNs,氮吹后经MCX小柱进行净化;李锋格等[ 18 ]采用1%(v/v)乙酸-乙腈溶液提取鸡肝中的SAs及QNs,之后用NH2吸附剂进行分散固相萃取净化,正己烷脱脂。总体来说,这些方法虽然净化效果较好,但步骤烦琐、实验成本高,操作不当容易造成目标化合物的损失。
本文采用乙腈均质提取、冷冻离心、正己烷液液分配除油,建立了UPLC-MS/MS高通量分析方法同时检测鸡肉中二氯二甲吡啶酚、SAs及QNs共9种药物残留量,方法更加简单、快速、灵敏,准确度高,满足了禽类产品中该类药物残留的高通量快速检测、确证的要求。
Agilent 6460超高效液相色谱-串联质谱仪(美国Agilent公司); Avanti J-30I型高速冷冻离心机(美国Beckman Coulter公司);高速组织捣碎机(德国IKA公司);甲酸、甲醇、乙腈和正己烷均为色谱纯(美国TEDIA公司);实验用水均为超纯水(电阻率为18.2 M Ω \5cm)。
标准品:二氯二甲吡啶酚(clopidol, CLO)、诺氟沙星(norfloxacin, NOR)、氧氟沙星(ofloxacin, OFL)、环丙沙星(ciprofloxacin, CIP)、恩诺沙星(enrofloxacin, ENR)、磺胺嘧啶(sulfadiazine, SDZ)、磺胺二甲基嘧啶(sulfamethazine, SMZ)、磺胺对甲氧嘧啶(sulfamethoxydiazine, SMD)、磺胺甲氧哒嗪(sulfamethoxypyridazine, SMPZ)均购自Dr. Ehrenstorfer公司,纯度均≥ 98.0% 。
标准储备液及工作液的配制:分别称取标准品各10.0 mg,用乙腈溶解后转移至100 mL棕色容量瓶中,用乙腈定容,于-20 ℃条件下保存。使用时将上述标准储备溶液混合,用流动相稀释成不同浓度的标准工作液。
色谱柱:Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱(50 mm×2.1 mm, 1.8 μ m);柱温:35 ℃;样品室温度:20 ℃;进样体积:10 μ L。流动相A为0.05%(v/v)甲酸水溶液;流动相B为乙腈。梯度洗脱程序:0～4 min, 5%B～12%B; 4～4.5 min, 12%B～20%B; 4.5～5 min, 20%B～90%B;然后保持1 min;之后由90%B降到5%B,保持4 min。流速为0.4 mL/min。
离子源:电喷雾电离源(ESI),正离子模式;干燥器温度:350 ℃;干燥气流速:6 L/min;雾化器压力:275.8 kPa;鞘流气温度:350 ℃;鞘流气流速:12 L/min,毛细管电压:3.0 kV;采用多反应监测(MRM)模式,9种药物在该模式下的质谱采集参数见表1。
取待测样品,经高速组织捣碎机均匀捣碎,称取5.00 g(±0.01 g)置于50 mL离心管中;加入5 g无水硫酸钠和10 mL乙腈,均质提取5 min;于-15 ℃下以 8000 r/min 冷冻离心10 min,将上清液转移至另一离心管中,残余物再用10 mL乙腈重复提取一次;合并两次提取上清液,于45 ℃水浴减压蒸干;残渣中加入1 mL流动相溶解,再加1 mL正己烷,振荡1 min;于 4000 r/min 条件下离心5 min,取下层液体过0.22 μ m滤膜,滤液用于LC-MS/MS测定。
目前报道的QNs、SAs的提取试剂很多,包括乙腈、甲醇、二氯甲烷等纯有机溶剂,添加一定比例的酸或碱的乙腈或甲醇,以及磷酸盐等缓冲溶液[ 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ]。而二氯二甲吡啶酚的化学性质较特殊,在正己烷、乙酸乙酯等非极性溶剂中不溶,在水中也不溶,只在甲醇和乙腈中微溶。因此在选择提取溶剂时,主要考察了甲醇和乙腈两种溶剂。结果发现乙腈去除蛋白的效果好,对这9种药物的提取回收率好于甲醇,因此选择乙腈为提取溶剂。实验考察了5、10、15、20 mL乙腈作为提取溶剂的提取效果。发现分两遍提取，每次加入10 mL乙腈可获得良好的回收率,再增加乙腈的量时回收率无明显提高。
比较了涡旋、超声、均质3种方式的提取效果,发现均质提取所用时间最短,回收率最高。其原因是高速均质可有效破坏样品组织,使提取试剂与目标分析物充分接触,从而提高了回收率。另外禽肉样品在提取过程中容易结块,因此提取时在样品中预先加入无水硫酸钠混合。无水硫酸钠具有除水和盐析作用,可以有效地防止样品中的水分及干扰成分进入提取液,同时硫酸钠的存在可促使蛋白变性分散,防止样品结成块状,增加提取效率。
禽肉样品基质中油脂含量较高,会影响回收率和测定结果的稳定性。乙腈提取液中含有许多共萃干扰物,主要以油脂为主。为去除基质中的脂肪类干扰物,采用高速冷冻离心除脂法,在低温状态下脂肪粒以固体状态从溶液中析出,以达到净化分离效果。实验比较了20、 0、-4、-10、-15 ℃条件下分别离心5、10、15、20 min的分离净化效果,发现在-15 ℃条件下冷冻离心10 min即可使提取液中的油脂析出,有效达到除脂效果。冷冻离心适用于样品中饱和脂肪酸类油脂的去除,而对于鸡肉中的一些不饱和脂肪酸,冷冻离心法则不能达到很好的净化效果。因此样品溶液在减压浓缩、复溶后,加入少量正己烷进行液液分配以除去不饱和脂肪酸类油脂杂质。冷冻离心与正己烷萃取两个净化步骤能有效地去除样品中的油脂类干扰物,整个实验前处理过程快速、简便、试剂耗量少。
在正离子ESI模式下,药物的准分子离子峰均以[M+H]+为主,因此选择各药物的[M+H]+作为碰撞诱导解离的母离子,然后利用MassHunter Optimizer工作软件对不同药物的特征离子、碎裂电压及碰撞能量进行自动查找优化,优化结果见表1。
QNs分子在结构上具有氨基和羧基,属于酸碱两性化合物,在水溶液中通常以离子形式存在，反相液相色谱分析时色谱峰容易拖尾。SAs分子在结构中含有-NH2,在流动相中加入甲酸,可增加其离子化效率。
对流动相进行考察,发现当以乙腈-水为流动相时,分析物的色谱峰形不理想,并且不易分离;在水中加入乙酸铵时,磺胺类峰形得到改善,但喹诺酮类色谱峰形仍不理想。而采用乙腈和0.05%(v/v)甲酸水溶液作为流动相时发现,当乙腈比例较低时QNs在色谱柱中的保留时间长,峰形差,拖尾严重;随着流动相中乙腈比例的增加,流动相的洗脱能力增强,QNs的峰形得到改善,但同时色谱柱的分离效率降低,磺胺对甲氧嘧啶与磺胺甲氧哒嗪不能达到基线分离,因为这两种药物的定量离子对完全相同,所以难以准确定量。另外,当乙腈比例过高时二氯二甲吡啶酚与磺胺嘧啶出峰过快,在色谱柱上得不到有效保留。经过不断优化,最终采用1.2.1节的条件实现了磺胺对甲氧嘧啶与磺胺甲氧哒嗪的良好分离,同时二氯二甲吡啶酚及喹诺酮类药物也获得了较好的峰形。
编辑仪器采集方法时,通过阀设置使溶剂在进样1 min后进入质谱仪,6 min时切换至废液,确保极性较强和极性较弱的杂质都在1 min之前和6 min之后被洗脱到废液中,大大地减轻对质谱仪的污染。
配制系列混合标准溶液,各药物质量浓度为2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μ g/L,上机测定。以目标物定量离子峰面积(y)为纵坐标对质量浓度(x, μ g/L)绘制标准曲线,得到线性回归方程(见表2)。各药物均在进样质量浓度为2.5 ～ 40.0 μ g/L 的范围内与其峰面积呈线性关系,相关系数均大于0.99。其中5.0 μ g/L 混合标准溶液的MRM图见图1。
添加水平为0.1 μ g/kg 时,各药物峰的信噪比均大于3,故将其定为检出限。定量限定义为在获得满意的回收率和标准偏差条件下,可以检测到的样品溶液中目标化合物的最低浓度。本方法的定量限为0.5 μ g/kg,该水平下的添加回收率为81.5% ～87.1% , RSD为2.6% ～8.9% ,满足GB/T 27404-2008 实验室质量控制规范的相关要求。
称取5.00 g(±0.01 g)空白试样,添加混合标准溶液使加标水平分别达到0.5、1.0和2.0 μ g/kg,充分混匀后按照本文建立的方法进行测定,每个添加水平进行6份平行测定。结果如表2所示,平均回收率为81.5% ～97.6% ,相对标准偏差为2.1% ～8.9% 。
运用本文所建立的方法对50份日常送检的鸡肉样品进行了筛查,方法简便、快速,在所检的样品中均未检出9种药物(含量小于0.5 μ g/kg)。
建立了鸡肉中二氯二甲吡啶酚、磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星等9种药物残留的超高效液相色谱-串联质谱测定方法。方法前处理过程简便、快速、试剂消耗量小,灵敏度高,可作为动物源性食品中这3类药物残留的确证检测方法。
2013, Vol. 31 Issue (12): 1161-1166
PDF (1527KB)
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