色谱柱:Hypersil BDS C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μ m;美国赛默飞世尔公司);流动相A为20 mmol/L 乙酸铵水溶液,流动相B为甲醇。梯度洗脱程序:0～8.0 min, 2.8%B; 8.0～9.5 min, 2.8%B～90%B; 9.5～17.5 min, 90%B; 17.5～30 min, 2.8%B。流速:1 mL/min;柱温:40 ℃;进样体积:10 μ L;紫外检测波长:230 nm。

LC条件:色谱柱为BEH C18柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μ m;美国Waters公司);流动相A为水,流动相B为乙腈。梯度洗脱程序:0～2.5 min, 10%B; 2.5～3.5 min, 10%B～90%B; 3.5～6 min, 90%B; 6～10 min, 10%B。流速为0.2 mL/min;进样体积为2 μ L。

IDMS条件:电喷雾离子源(ESI);负离子扫描方式;多反应监测(MRM)模式;毛细管电压:2.5 kV;干燥气温度:500 ℃;干燥气流速:900 L/h;苯甲酸的定量离子对:m/z 121.0/77.1(锥孔电压:36 V;碰撞能量:12 eV);同位素标记苯甲酸的定量离子对:m/z 127.1/83.1(锥孔电压:40 V;碰撞能量:10 eV)。

图1

Fig. 1

图1 不同实验室间橙汁样品测定(APMP.QM-P23)结果图 Fig.1 Determination results of an orange juice sample from different laboratories (APMP.QM-P23)

按1.3节所述方法对橙汁样品进行分析,在合适的色谱条件下,苯甲酸与其他组分可以达到较好的分离。由于橙汁样品的组成复杂,还考虑了用固相萃取(SPE)的方法进行初步净化处理^{[ 10 ]}。将离心后的加标橙汁样品5 mL转移到固相萃取柱OASIS-WAX(6 mL, 150 mg, 30 μ m;预先依次用5 mL甲醇和5 mL水活化)中,分别用5 mL 2%甲酸水溶液和5 mL水淋洗,最后用5 mL氨化甲醇溶液(氨水-甲醇(5 ∶ 95, v/v))洗脱,抽至近干。洗脱液经HPLC分析,并与未经SPE处理的加标橙汁样品的色谱图比较(见图2),苯甲酸及其相邻组分的分离度并没有明显改善,只是更大极性的组分在淋洗阶段被去除。考虑到分析时间以及操作的简便性和重复性等因素,最终选择了直接进样分析而没有采用固相萃取的前处理方法。

图2

Fig. 2

图2 SPE柱净化对橙汁样品中苯甲酸分离效果的影响 Fig.2 Effect of SPE on the separation of benzoic acid in an orange juice sample a. without SPE clean-up; b. after SPE clean-up. BA: benzoic acid.

实验中发现,在过滤过程中,滤膜对苯甲酸有少量的吸附,可能是由滤膜的材质和特性引起的。本研究比较了0.2 μ m Nylon、0.2 μ m GHP和0.45 μ m GHP等3种滤膜对苯甲酸测定的影响,苯甲酸在3种滤膜上吸附率分别为2.3% 、0.9%和1.5% ,故采用0.2 μ m GHP滤膜过滤。

本实验分别考察了Zorbax Eclipse Plus C18(150 mm×4.6 mm, 5 μ m)和Hypersil BDS C18(250 mm×4.6 mm, 5 μ m)两种色谱柱和流动相体系对橙汁样品中苯甲酸分离效果的影响。

采用Zorbax Eclipse Plus C18色谱柱,采用我国国家标准方法中测定苯甲酸所用的流动相体系^{[ 7 ]},即甲醇-20 mmol/L 乙酸铵体系,苯甲酸与橙汁中的干扰组分不能达到完全分离(见图3a)。本文考察了流动相中添加酸对分离效果的影响。从图3可以看出,随着流动相中乙酸含量的增加,苯甲酸的保留时间逐渐延长,当流动相组成为甲醇-20 mmol/L 乙酸铵-0.01%乙酸水溶液体系时,苯甲酸与橙汁中的其他组分得到了较好的分离。这是由于苯甲酸是弱酸,在中性流动相中部分解离以离子形态存在,在C18柱上的保留相对较弱,导致出峰时间靠前。而当流动相中加入乙酸后,随着流动相pH的降低,苯甲酸的解离受到抑制,而以分子形态存在,故在C18柱上的保留变强,从而出峰时间延后^{[ 17 ]}。

图3

Fig. 3

图3 流动相体系中添加不同含量的乙酸对橙汁样品中苯甲酸分离效果的影响 Fig.3 Effect of acetic acid content added in mobile phase system on the separation of benzoic acid in orange juice Column: Zorbax Eclipse Plus C18(150 mm×4.6 mm, 5 μ m). Mobile phase system: methanol-20 mmol/L NH4OAc-acetic acid with different volume percentages; volume percentages of acetic acid: a. 0% ; b. 0.002% ; c. 0.005% ; d. 0.01% ; e. 0.02% . BA: benzoic acid.

采用Hypersil BDS C18色谱柱,采用我国国家标准方法中测定苯甲酸所用的甲醇-20 mmol/L 乙酸铵流动相体系,将流动相比例进一步优化,当甲醇的初始比例为2.8%时,样品中的苯甲酸与相邻组分可以达到较好的分离。

以上实验结果表明,分别采用两种色谱柱及对应的色谱条件均可以对橙汁中苯甲酸进行测定,本研究采用Hypersil BDS C18色谱柱及相对简单的甲醇-乙酸铵体系完成后续橙汁中苯甲酸含量的测定。

分别考察了柱温为30、35和40 ℃时橙汁样品的分离效果。从图4中可以看出,色谱柱温度的改变会在一定程度上影响样品中苯甲酸的保留时间以及其与干扰物的分离度。在40 ℃时,苯甲酸能够与样品中干扰组分实现较好的分离,并且所需分析时间最短,所以柱温选为40 ℃。

图4

Fig. 4

图4 柱温对橙汁样品中苯甲酸分离效果的影响 Fig.4 Effect of column temperature on the separation of benzoic acid in an orange juice sample

本实验考察了甲醇-水(1 ∶ 4, v/v)和甲醇-10 mmol/L 乙酸铵(1 ∶ 4, v/v)两种混合稀释溶剂对苯甲酸色谱行为的影响。图5a和图5b分别为以甲醇-水和甲醇-乙酸铵作稀释溶剂时在甲醇-水流动相条件下的色谱图,从图5中可以看出稀释溶剂为甲醇-10 mmol/L 乙酸铵(1 ∶ 4, v/v)时苯甲酸和内标的色谱行为都较甲醇-水(1 ∶ 4, v/v)时有明显的改善。

图5

Fig. 5

图5 不同稀释溶剂条件下苯甲酸及其同位素内标的多反应监测色谱图 Fig.5 MRM chromatograms of benzoic acid and isotope internal standard by dilution with different solvents a. dilution with methanol-water (1 ∶ 4, v/v), methanol-water as mobile phase system; b. dilution with methanol-10 mmol/L ammonium acetate (1 ∶ 4, v/v), methanol-water as mobile phase system; c. dilution with methanol-10 mmol/L ammonium acetate (1 ∶ 4, v/v), acetonitrile-water as mobile phase system.

如上所述,在色谱分离过程中加入缓冲盐有助于苯甲酸及其内标色谱行为的改善,但是实验发现若流动相中加入缓冲盐(例如10 mmol/L 乙酸铵)则严重影响待测组分在质谱检测时的离子化效率,进而影响待测组分的检出限。于是,本文在样品稀释溶剂中加入缓冲盐(2.2.1节所述)的前提下,考察了分别在甲醇-水(图5b)和乙腈-水(图5c)两种不含缓冲盐的流动相体系下待测组分的色谱行为。结果表明,两种体系下待测组分都有较好的信噪比,乙腈-水体系下待测组分的峰形优于甲醇-水体系,更适合于实际样品的分析检测。

HPLC-UV用混合溶剂(空白橙汁-甲醇-水(5 ∶ 4 ∶ 16, v/v/v))稀释苯甲酸标准储备液,对含量范围为0.5～200 mg/kg 的一系列苯甲酸标准溶液进行了HPLC测定。以峰面积y对含量x作图得标准曲线方程为y=30291x-218.92(r²=1.0000),表明在0.5～200 mg/kg 范围内线性关系良好。采用在空白基质中添加目标组分的方法,以信噪比(S/N)大于3确定方法检出限(LOD)为0.75 mg/kg。

LC-IDMS在本方法所确定的实验条件下,对含量范围为0.01～0.5 mg/kg 的苯甲酸标准溶液进行LC-IDMS测定。以分析物与内标物峰面积的比值y对分析物含量x做标准曲线,得到标准曲线方程为y=0.0089x+0.0755(r²=0.9999)。以S/N＞3确定方法LOD为0.05 mg/kg。

以市售某品牌100%橙汁为空白样品,在其中添加100 mg/kg(与比对样品中苯甲酸真实含量接近)的苯甲酸标准溶液进行添加回收试验,按选定的方法进行样品的前处理和测定,重复6次,采用HPLC-UV方法测定的平均加标回收率为99.4% ,相对标准偏差(RSD)为0.16% ;采用LC-IDMS方法测定的平均加标回收率为99.6% , RSD为0.61% 。

在相同的色谱条件下,将样品溶液的色谱图与标准溶液的色谱图对照,根据保留时间定性。在进样体积相同的条件下,采用括弧法(bracketing method)定量,计算比对样品中苯甲酸的含量,测定结果和有关参数有以下函数关系:

式中:X为橙汁样品中苯甲酸的含量(mg/kg);A为样品溶液中苯甲酸的峰面积;A_l为低浓度苯甲酸标准溶液中苯甲酸的峰面积;A_h为高浓度苯甲酸标准溶液中苯甲酸的峰面积;C_l为低浓度苯甲酸标准溶液的苯甲酸含量(mg/kg);C_h为高浓度苯甲酸标准溶液的苯甲酸含量(mg/kg);m为称取橙汁样品的质量(g);W为样品溶液的质量,为实际样品加溶剂之后的质量(g)。

每瓶比对样品取样3次,按选定的方法进行样品的前处理和测定。分析时先以低浓度标准溶液、样品、高浓度标准溶液的次序进行一组测定,下一组时则以相反的次序进样,如此重复分析3次完成一瓶比对样品的分析。2瓶橙汁比对样品中苯甲酸的测定结果为(102.5±1.4) mg/kg (k=2)。

测定结果的不确定度主要由测定结果的重复性、苯甲酸溶液标准物质和样品称量等引入的不确定度组成,具体表现为以下3个部分。

⑴测定结果重复性引入的不确定度u₁。

色谱仪器的稳定性、比对样品的均匀性、离心过滤等样品预处理过程对测定结果造成的误差均体现在测定重复性中,由6次测定结果的相对标准偏差表示,得到u₁=0.40% 。

⑵配制苯甲酸标准溶液引入的不确定度u₂。

包括GBW(E)100006 苯甲酸溶液标准物质的不确定度0.5% 、苯甲酸溶液标准物质称量引入的不确定度 0.0184%和溶剂称量引入的不确定度 0.000368% 。合成标准溶液不确定度

。

⑶样品制备引入的不确定度u₃。

包括样品称量引入的不确定度 0.0046% 、溶剂称量引入的不确定度 0.00115% 。合成样品溶液不确定度。

将以上3项不确定分量合成,得到合成和扩展不确定度:合成相对标准不确定度;相对扩展不确定度U_rel=2×u_LC=1.28%(k=2);扩展不确定度U=C×U_rel=102.48×1.28%=1.32 mg/kg (k=2)。

样品中苯甲酸与内标的含量比和峰面积比在两个校正标准之间符合线性关系。橙汁中苯甲酸的含量可采用括弧法由以下公式计算:

式中:X为橙汁样品中苯甲酸的含量(mg/kg); R为上机样品溶液中苯甲酸与标记苯甲酸的峰面积比;R_l为低浓度苯甲酸标准溶液中苯甲酸与标记苯甲酸的峰面积比;R_h为高浓度苯甲酸标准溶液中苯甲酸与标记苯甲酸的峰面积比;W_l为低浓度苯甲酸标准溶液中苯甲酸与标记苯甲酸的质量比;W_h为高浓度苯甲酸标准溶液中苯甲酸与标记苯甲酸的质量比;C_IS上机样品溶液中标记苯甲酸的含量(mg/kg); K为橙汁样品的稀释倍数,按稀释成最终上机样品溶液的含量计算。

每瓶比对样品取样3次,按选定的方法进行样品的前处理和测定。分析时先以低浓度标准溶液、样品、高浓度标准溶液的次序进行一组测定,下一组时则以相反的次序进样,如此重复分析3次完成一瓶比对样品的分析。2瓶橙汁比对样品中苯甲酸的测定结果为(101.6±1.6) mg/kg (k=2)。

测定结果的不确定度的主要组成与HPLC-UV相同。

⑴测定结果重复性引入的不确定度u₁。

引入的原因与HPLC-UV相同,LC-IDMS的u₁=0.56% 。

⑵配制标准溶液引入的不确定度u₂。

包括GBW(E)100006 苯甲酸溶液标准物质的不确定度0.5% 、苯甲酸标准溶液第一次稀释引入的不确定度0.023% 、苯甲酸标准溶液第二次稀释引入的不确定度0.012% 和加内标后混合标准溶液配制引入的不确定度 0.0067% 。合成标准溶液不确定度 。

⑶样品制备引入的不确定度u₃。

包括样品溶液第一次稀释引入的不确定度 0.0069% 、样品溶液第二次稀释引入的不确定度 0.0092%和样品中添加标记苯甲酸引入的不确定度 0.0067% 。合成样品溶液不确定度

。

将以上3项不确定分量合成,得到合成和扩展不确定度:合成相对标准不确定度

;

相对扩展不确定度U_rel=2×u_IDMS=1.52%(k=2);扩展不确定度U=C×U_rel=101.60×1.52%=1.55 mg/kg(k=2)。

两种方法合成标准不确定度;相对扩展不确定度U_rel=2×u=1.98%(k=2);扩展不确定度U=C×U_rel=102.04×1.98%=2.02 mg/kg(k=2)。

本实验室采取HPLC-UV和LC-IDMS两种方法测定结果的平均值作为比对样品中苯甲酸的含量测定值,对两种方法的标准不确定度进行合成,并进行扩展(k=2)。综上橙汁比对样品中苯甲酸的含量为(102.0±2.1) mg/kg(k=2)。