异硫氰酸荧光素(FITC，纯度97.5%)、腐胺(纯度>98%)、组胺(纯度>98%)、亚精胺(纯度>98%)的标准品购自Sigma公司,乙腈(色谱纯)、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和乙酸铵均为分析纯,实验用水均为Milli-Q超纯水。FITC以含0.8%(如无特殊说明均为体积分数)甲醇和0.5%吡啶的乙腈溶液溶解,配制成1 mmol/L母液，4 ℃保存,使用时以同样的乙腈混合溶液稀释。生物胺标准品用水溶解，配制成1 mmol/L母液，4 ℃保存,使用时用50 mmol/L的磷酸二氢钠溶液(pH 10.95)稀释至所需浓度。

P1201高压恒流泵，EC2006色谱数据处理工作站,Hypersil ODS2色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μ m)均为大连依利特分析仪器有限公司产品。检测器为该公司新研制的共聚焦激光诱导荧光检测器,激发波长473 nm,中心发射波长525 nm。

生物胺衍生:取10 μ mol/L的腐胺、组胺和亚精胺混合溶液(30、20、10、5、2、1、0.5 μ L)或水样0.1 mL,分别置于7个2 mL棕色石英瓶中;依次加入450 μ mol/L的FITC溶液(90、60、30、15、6、3、1.5 μ L)或450 μ mol/L的FITC溶液20 μ L，以衍生缓冲液(50 mmol/L的磷酸二氢钠溶液，用氢氧化钠溶液调节pH至10.95)稀释至500 μ L；混匀后室温下避光反应4 h；然后用水稀释至1 mL，进样分析。

茶叶样品的提取和衍生:称取0.1 g茶叶,加10 mL水煮沸30 min;取上述提取液0.1 mL,加入衍生缓冲液(同上)340 μ L及45 μ mol/L 的FITC 60 μ L,置于暗处衍生反应6 h,用水稀释一倍后进样分析。

色谱柱:Hypersil ODS2(150 mm×4.6 mm，5 μ m); 流速: 1 mL/min;室温进样20 μ L。流动相A为10 mmol/L乙酸铵溶液(pH 6.8), B为乙腈。梯度条件:分析环境水中的生物胺时为0-2-8-8.1 min, 10%B-15%B-17%B-50%B；分析茶水中的生物胺时为 0-15-25 min，5%B-20%B-50%B。

以3种生物胺标准品为样品对色谱柱类型、缓冲盐种类、pH和浓度进行了考察。胺类物质中的N原子容易与固定相基质上的硅羟基产生静电作用、氢键作用,与残留的金属离子产生络合作用,导致分离效果变差。对比了Hypersil ODS2和Sinochrom ODS-BP两种色谱柱的分离效果。相比于后者,前者的硅胶基质纯度更高,且封尾程度更高,因此其对生物胺的分离效果要好于后者。

对比了分别选用磷酸盐溶液和乙酸铵溶液为流动相时生物胺在色谱柱上的分离情况。结果表明，乙酸铵溶液为流动相时生物胺的分离情况更好。因为乙酸铵屏蔽了固定相表面残留的硅羟基，削弱了其对碱性物质分离的不利影响。

随着流动相酸性减弱,样品在色谱柱上的保留增强,同时色谱峰峰高增大。生物胺衍生产物在碱性条件下的荧光效率更高,但在高pH条件下分离不佳，而pH 6.8时的实验效果最佳。

同时，分别使用5、10、15、20 mmol/L 的乙酸铵溶液为流动相A,考察了生物胺在不同盐浓度下的保留行为。结果表明在10 mmol/L 时3种生物胺的分离情况最佳。后续实验使用1.3节实验条件，13 min内3种生物胺得到了基线分离(见图1)。

图 1 优化条件下3种生物胺衍生溶液的色谱图 Fig. 1 Chromatogram of the three bioamines under the optimized conditions Mobile phase A: 10 mmol/L ammonium acetate solution(pH 6.8), B： ACN; gradient program: 0-2-8-8.1 min, 10%B-16%B-19%B-50%B; column: Hypersil ODS2(150 mm×4.6 mm, 5 μ m); flow rate: 1.0 mL/min; injection volume: 20 μ L. The concentration of each amine was 50 nmol/L. 1. spermidine; 2. putrescine; 3. putrescine.

FITC与胺类物质的衍生产物荧光量子产率高^{[ 12 ]},但FITC自身水解会带来很多的杂质,对分析产生极大的影响。将FITC的乙腈溶液分别用乙腈、水和衍生缓冲溶液稀释,室温下避光放置4 h后进样分析,考察FITC的水解产物。结果如图2所示，FITC在乙腈溶液中性质稳定,只有一个杂质峰,而在水溶液中FITC水解产生很多的杂质峰。

图 2 不同溶剂中FITC水解产物色谱图 Fig. 2 Chromatograms of FITC hydrolysates in different solvents a. acetonitrile; b. 50 mmol/L phosphate buffer (pH 10.95); c. water. The conditions were the same as in Fig. 1.

FITC与氨基酸的衍生反应一般在常温下避光反应12 h以上,生物胺的反应活性较氨基酸高,因此用FITC衍生生物胺所需时间更短。以生物胺为样品,对比了衍生6 h与4 h的差别,结果表明4 h后生物胺已衍生完全，确定后续实验中生物胺的衍生时间为4 h。因为茶叶提取物成分复杂,为提高衍生效率对其衍生时间延长为6 h。

将亚精胺、腐胺和组胺标准品衍生之后于4 ℃下保存，分别在衍生当天、衍生第2天和第3天进样分析。实验结果表明,连续3天进样衍生产物色谱峰面积基本没有变化,说明样品衍生后在4 ℃保存的稳定性良好。

在确定的衍生和分离条件下,将不同浓度的生物胺标准品溶液用FITC衍生后进样分析,考察3种生物胺色谱峰面积(y)与浓度(x，nmol/L)之间的线性关系。结果表明,在一定浓度范围内3种物质的浓度与峰面积具有良好的线性关系(见表1)。

表 1 3种生物胺浓度与色谱峰面积的线性关系及检出限 Table 1 Linear relationships between peak areas and concentrations of three bioamines and LODs Bioamine Linear range/ (nmol/L) Linear equation r2 LOD/ (nmol/ L) LOQ/ (nmol/ L) Spermidine 50-300 y=14.05x-488.51 0.995 0.13 0.43 Putrescine 5-50 y=7.25x-24.55 0.999 0.22 0.73 Histamine 10-100 y=8.86x-64.37 0.999 0.23 0.77 y: peak area; x: concentration, nmol/L.

表 1 3种生物胺浓度与色谱峰面积的线性关系及检出限 Table 1 Linear relationships between peak areas and concentrations of three bioamines and LODs

检出限(LOD)以三倍信噪比确定，定量限(LOQ)以十倍信噪比确定。3种生物胺的LOD低达10^-10 mol/L数量级。其中亚精胺和腐胺的LOD较毛细管电泳-激光诱导荧光法^{[ 12 ]}(亚精胺:1.92 nmol/L, 腐胺:1.80 nmol/L)低一个数量级；其中亚精胺和组胺的LOD较HPLC-MS法^{[ 8 ]}(亚精胺:39.9 nmol/L, 组胺:15.3 nmol/L)低两个数量级。

以50 nmol/L的FITC衍生化生物胺连续进样5次,亚精胺、腐胺和组胺保留时间的RSD分别为0.23% 、0.13% 、0.11% ;峰面积的RSD分别为0.47% 、1.42% 、2.83% 。

以某矿泉水成品水为样品,添加3种生物胺标准品至浓度为20 nmol/L,然后进行衍生后进样分析。亚精胺、腐胺和组胺的平均加标回收率分别为104.7% 、107.76%和94.99% , RSD(n=3)分别为0.08% 、0.33%和0.16% 。

取某矿泉水厂原水、成品水和矿泉水厂当地的地表水，分别衍生后进样分析。结果如图3所示，3种水样中均未检测到亚精胺、腐胺或组胺。由结果可以看出,利用LIFD的高选择性和高灵敏度可排除大量非荧光杂质的干扰,实现了水样直接进行衍生后进样分析，而不需其他前处理,缩短了样品分析时间。

图 3 实际水样的色谱图 Fig. 3 Chromatograms of the real water samples a. spiked sample (50 nmol/L); b. blank; c. source water of a mineral water factory; d. mineral water product; e. ground surface water. Gradient program: 0-2-8-8.1 min, 10%B-15%B-17%B-50%B; other conditions were the same as in Fig. 1. 1. spermidine; 2. putrescine; 3. histamine.

茶叶中含有大量有生物活性的生物碱，具有抗衰老、抗肿瘤等作用。这些生物碱往往都是含有氨基的胺类物质，以热水浸泡茶叶，是提取茶叶中胺类物质的有效方式，Saito等^{[ 13 ]}用80 ℃水提取浸泡茶叶，研究了提取液中的咖啡因等物质，黄晓佳等^{[ 14 ]}用沸水提取并研究了茶叶中的嘌呤碱。我们按照1.2节方法，用沸水提取大红袍(红茶)、正山小种(红茶)、竹春芽(花茶)、二次茶(各种茶叶提取后晾干所得)、散装龙井(绿茶)、龙井(1和2)，并用FITC衍生，对胺类物质进行了分析。经衍生后，茶叶中的蛋白质、氨基酸、茶叶碱和其他含有伯氨基团的胺类物质均会发射与检测器匹配的荧光，能用LIFD进行检测，结果见图4。

图 4 7种茶水中胺类物质的色谱图 Fig. 4 Chromatograms of the amines in the seven tea samples a. Dahongpao tea； b. Zhengshan xiaozhong tea； c. Zhuchunya tea； d. used tea； e. dragon well tea in bulk； f. dragon well tea 1； g. dragon well tea 2. Gradient program： 0-15-25 min， 5%B-20%B-50%B. Other conditions were the same as in Fig. 1.

由图4可以看出，7种茶水色谱图中色谱峰分布基本一致，有少数色谱峰强度存在差异，说明其中所含胺类物质种类基本一致。