中药一直是我国人民防病治病的重要工具,对保障国人健康和中华民族繁衍昌盛发挥了巨大的作用。近年来,随着一些安全事件的爆发,食品、药品安全问题越来越引起人们的重视,农药残留问题就是其中之一。农药残留问题更在一定程度上影响着我国中药材产业的现代化和国际化[ 1 ]。
参考其他国家标准,新版《欧洲药典》制订了70多项涉及105种农药的最大残留限量(maximum residue limit, MRL)[ 2 ]。《美国药典》、《英国药典》和日本《肯定列表制度》也分别规定了药材中上百种农药最大残留限度标准[ 3, 4, 5 ]。我国2010年版《中国药典》只规定了9种有机氯农药、12种有机磷农药、3种拟除虫菊酯农药残留量的检测方法[ 6 ],而且在限量标准方面仅规定了甘草和黄芪两种药物的六六六、滴滴涕、五氯硝基苯的限量标准,其他中药材尚未涉及[ 7 ],这与其他国家的标准有较大差距。同时我国食品标准中农药残留检测品种达500余种,相比之下,中药材中农药残留的检测品种少,前处理方法落后,灵敏度和专属性也存在一定的问题,易产生假阳性和假阴性的结果[ 1 ]。因此建立中药材农药多残留的检测新方法十分必要。
目前检测中药材中农药残留的研究中,多采用气相色谱(GC)[ 8 ]、气相色谱-质谱(GC-MS)[ 9 ]、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)[ 10 ]、气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)[ 11 ]。利用GC或GC-MS进行农药多残留的检测,很多农药不易分开,而且易出现假阳性的情况。相对于一级质谱,二级质谱抗干扰能力强,可以实现几百种农药的同时检测。
QuEChERS方法是由美国农业部农业研究服务中心开发的一种快速、简便、价格低廉、环境友好的预处理方法,是实验室大规模样品处理较理想方法,有较高的实际应用价值。目前,采用QuEChERS方法主要有3种方式:未加缓冲盐的原创QuEChERS方法[ 12 ]、加乙酸盐缓冲液的美国分析化学家协会(Association of Official Analytical Chemists, AOAC)标准方法[ 13 ]以及加入柠檬酸盐以获得稳定pH的EN15662方法[ 14 ]。QuEChERS方法应用于农药多残留检测过程中,对于酸碱度敏感的农药,一般需要用缓冲溶液来减少因pH值的波动引起的农药(如异菌脲,克菌丹,苯线磷等)的降解,从而得到满意的回收率。2011年,Xu等[ 8 ]应用乙酸-乙酸钠作为缓冲溶液测定中药材中的多农药残留。2008年,Lehotay等[ 15 ]利用柠檬酸二钠盐和柠檬酸三钠盐为缓冲溶液测定水果和蔬菜中的农药残留。本文以QuEChERS作为样品前处理方法,考察了不同提取溶剂、净化剂、缓冲溶剂等对添加回收率的影响,探究了144种农药的GC-MS/MS测定方法,对人参、西洋参、黄芪、当归、金银花、枸杞、茯苓、牡丹皮、甘草、白术、枇杷叶等11种中药材中的农药残留进行了筛查测定,取得了满意的结果。
Trace GC Ultra气相色谱仪、TSQ Quantum GC三重四极杆串联质谱仪(美国Thermo Fisher公司),配AI/AS 3000自动进样器;电子天平TE612-L(德国Sartorius公司);高速冷冻离心机D-78532(德国Hettich公司);旋转蒸发仪N-1100(日本EYELA公司); Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)。
乙腈、正己烷(色谱纯,美国Thermo Fisher公司);丙酮、甲苯、乙酸乙酯(色谱纯,美国J. T. Baker公司);氯化钠、无水硫酸镁、无水乙酸钠、乙酸(分析纯,国药集团化学试剂有限公司); N-丙基乙二胺(PSA)吸附剂、碳十八(C18E)吸附剂、中性氧化铝(Alumina-N)、氨基(Cleanert NH2)填料、石墨化炭黑(GCB)填料(中国Agela Technologies公司);实验用水为Milli-Q超纯水系统制成的超纯水;150种农药标准品(纯度均大于90% ,德国Dr. Ehrenstorfer公司)。
各农药标准储备液:分别准确称取一定量的农药标准品,置于5 mL的小烧杯中,用甲苯溶解后转移到10 mL容量瓶中,用甲苯定容,配制成约为 1000 mg/L 的标准储备液,-18 ℃贮存备用。
混合工作储备液:分别取一定量的上述标准储备液于100 mL容量瓶中,用甲苯稀释定容,配制成混合工作储备液,各农药的质量浓度均为2.0 mg/L,储存在-18.0 ℃冰箱中备用。
制作标准曲线的标准溶液:分别取2.5、5.0、25.0、50.0、75.0、100.0、250.0、500.0 μ L的混合工作储备液,用甲苯定容到1 mL,配制成5.0、10.0、50.0、100.0、150.0、200.0、500.0、1000.0 μ g/L 的系列标准溶液。现用现配。
色谱柱:Agilent Technologies DB-5MS (30 m×0.25 mm, 0.25 μ m)。程序升温气化(programmed-temperature vaporization, PTV):初始温度70.0 ℃,以14.5 ℃/s速率升温到330.0 ℃,保持2 min。PTV后清洗程序:以14.5 ℃/s速率降温到200.0 ℃,保持1.0 min。柱温箱程序升温:初始温度80.0 ℃,保持0.5 min后以18.0 ℃/min 升至150.0 ℃,保持0.5 min;然后以4.0 ℃/min 升至260.0 ℃;最后以15.0 ℃/min 升至300.0 ℃,保持5 min。 载气:氦气(纯度99.999% )。恒流模式:1.2 mL/min。进样量:1.0 μ L。
电离模式:电子轰击(EI);轰击能量:70 eV;灯丝电流:60 μ A;离子源温度:250.0 ℃;传输线温度:300.0 ℃;碰撞气:氩气(纯度99.999% );溶剂延迟时间:4.5 min;扫描方式:选择反应监测(SRM)。144种农药保留时间及质谱参数见表1。Xcalibur 2.1工作站用于仪器控制和数据处理。
根据SN/T 1957-2007[ 16 ]的要求将样品粉碎,并过2.0 mm筛。随后称取5.00 g上述样品，置于50 mL具塞塑料离心管中,加入15.0 mL水浸润样品,静置15 min。然后加入20.0 mL含体积分数为0.1%的乙酸的乙腈溶液、4.00 g氯化钠、0.20 g无水乙酸钠,漩涡混匀2 min,超声提取30 min。再以6000 r/min的速率离心8 min,取4.0 mL上清液于鸡心瓶中,于30 ℃下旋转蒸发至近干。向其中加入2.0 mL甲苯复溶,取1.5 mL溶液置于2.0 mL净化离心管中,管内预先装有200 mg PSA、200 mg C18、150 mg无水硫酸镁和适量GCB,振荡漩涡2 min,然后以6000 r/min的速率离心5 min,取上清液过0.22 μ m的有机相滤膜,滤液供GC-MS/MS检测。
本文依据《中国药典》(2010 版)、《欧洲药典7.0》、《日本肯定列表制度》药草部分、《美国药典34》等药典涉及的农药目录,结合我国常用于中药材种植中的农药种类,选择了150种作为目标分析化合物。在实验过程中剔除了基质效应严重、响应值不高、定量效果差的农药辛硫磷、吡虫啉、氯酯磺草胺,剔除了在一定温度下能降解生成敌敌畏的敌百虫和高温易分解的农药敌菌丹、异丙威,最终确定了144种农药目标物。
以Xcalibur 2.1工作软件的选择反应监测模式(SRM)为扫描方式。根据目标化合物的保留时间把扫描分为7个扫描窗口,使每个时间段的扫描离子对数量适中,调整离子对扫描时间(scan time),保证每个目标化合物色谱峰的采集点数量在15个点左右,并且响应值满足要求。优化得到的质谱参数见表1。
基质效应是在分析复杂基质农药残留时需要考虑的一个重要问题。与液相色谱-质谱联用法不同,气相色谱-串联质谱法的基质效应以增强为主。Erney等[ 17 ]经过研究分析了两类易产生基质增强效应的化合物,一类是在汽化温度下热不稳定的化合物,一类是样品进入色谱柱或检测器时易被吸附的化合物。通过与纯溶剂标准溶液比较,可以说明基质诱导响应增强的农药回收率增高是由于基质的保护作用,因为纯溶剂不能为待分析农药提供足够的保护,所以纯溶剂标准溶液的实际响应值低于其本应该产生的值。而在空白基质溶液中添加相同浓度的农药,可使农药更加完全地转移到色谱柱中,从而响应增加,在这个过程中基质起到了分析保护作用。
基质效应可以用基质效应因子(matrix factor, MF)来表示,MF=X/Y×100% 。X为纯溶剂中农药的平均响应值,Y为空白样品基质中添加相同含量的农药的平均响应值。以人参为例发现,基质效应明显增强(MF＞150% )的农药有克菌丹、三唑酮、二嗪农、稻丰散；基质效应呈明显减弱趋势(MF＜70% )的有乙酰甲胺磷和稻瘟酰胺；有138种化合物的MF在70% ～150%之间。
由于同一目标物在不同基质中所受的基质效应的大小不同,因此可以使用对应的空白基质配制标准曲线进行校正,一定程度上减弱了基质效应对目标物的影响。
目标化合物包括有机磷、有机氯、拟除虫菊酯类等多种农药,而且复杂中药材基质含糖量高并含有氨基酸、多种活性成分和挥发性物质,所以要求提取溶剂对农药有足够的溶解性和一定的选择性。本实验比较了6种常用提取溶剂:乙腈、丙酮、乙腈-丙酮(1 ∶ 1, v/v)、乙酸乙酯、正己烷、正己烷-丙酮(4 ∶ 1, v/v)。通过比较提取液的颜色,测试不同提取溶液的背景干扰情况,以样品加标回收率试验为指标,综合考察提取溶剂的提取效果。
从提取液颜色观察,由深到浅分别是丙酮＞乙腈-丙酮(1 ∶ 1, v/v)＞乙腈＞正己烷-丙酮(4 ∶ 1, v/v)＞乙酸乙酯＞正己烷。说明丙酮对色素类杂质提取多,不适用于颜色深的样品。
采用不同提取溶剂对144种农药进行添加回收率试验。由图1看出回收率(n=4)满足要求的有乙腈-丙酮(1 ∶ 1, v/v)、丙酮、乙酸乙酯和乙腈。
图2为添加回收率试验满足要求的4种提取溶剂提取空白人参基质得到的初级萃取液全扫模式(full scan mode)的总离子流图(TIC)。从图2可看出,乙腈提取中药材中的杂质明显少于其他溶剂,其次是乙酸乙酯。
综合上述分析,乙腈和乙酸乙酯是两种效果较好的提取溶剂。参考Lehotay等[ 15 ]和Beyer等[ 18 ]的研究发现,乙酸乙酯提取液经过净化后含有更多的基质物质不是因为在初提取中提取了更多的基质物质,而是在净化过程中乙酸乙酯提取液中的基质物质更不易被净化,导致基质物质残留量比乙腈的多。乙腈作提取溶剂同时还具有以下优点:在盐饱和的状态下可以与水完全分离而不需要引入非极性溶剂;应用于气相色谱分析有很好的适用性。故本实验选择乙腈作为提取溶剂。
本文考察了乙腈在下列3种条件下提取样品的方法:方法一是直接用乙腈提取,方法二是加入乙酸盐缓冲溶液条件下提取,方法三是加入柠檬酸盐缓冲溶液提取;其中方法二和方法三调节pH在5.0～6.0之间。如表2所示,方法一的回收率明显低于方法二和方法三。比较方法二和三,发现方法二的回收率略高于方法三,但差异不明显。在实际操作过程中,乙酸盐缓冲液体系(pH 5.0～6.0)的抗基质自身酸碱度干扰的能力强,适合于多种中药基质。参考Lehotay等[ 15 ]的方法,本实验选择乙酸盐缓冲溶液作为提取的缓冲体系。
根据文献[ 19, 20 ],在QuEChERS中,以乙酸-乙酸钠的比例(1 mL乙酸/10 g乙酸钠)可使样品提取液处于pH约为5.5的平衡缓冲状态。AOAC方法中乙酸用量是提取溶剂的1%(v/v),而乙酸为挥发酸,用量高会对进样口、色谱柱等仪器部分有一定的腐蚀破坏。因此本文中考察了两个乙酸添加水平(0.20 mL乙酸+2.00 g乙酸钠和0.02 mL乙酸+0.20 g乙酸钠)下提取样品对144种农药回收率的影响,在人参中的试验结果见表3。可见两个添加水平下的提取效率相近。但考虑到乙酸对整个仪器的影响,本实验选择用量较少的0.02 mL乙酸+0.20 g乙酸铵组合作为缓冲体系。
AOAC 2007.01 方法使用PSA主要去除糖类、脂肪酸、有机酸、酚类和亲脂性色素等极性物质,C18是QuEChERS最为重要的净化剂。Lehotay等[ 15 ]和Koesukwiwat等[ 21 ]的研究表明,C18和PSA的实际应用范围广,相对于弗罗里硅土(Florisil)和中性氧化铝(Al2O3-N), C18和PSA对农药的回收率影响很小,但对色素的净化效果均不理想。GCB主要去除色素等物质,但因其在多残留农药的检测中会导致回收率的下降,在无颜色或者浅颜色的基质中应尽量避免使用。本文选择浅颜色的人参主要考察了几种净化剂组合(PSA(300 mg)、PSA(150 mg)+C18(150 mg)、PSA(150 mg)+Al2O3-N(150 mg)、PSA(150 mg)+Florisil(150 mg)、C18(300 mg))的净化效果。从净化液的颜色方面观察,由浅到深的分别是：PSA、PSA+Florisil、PSA+Al2O3-N、PSA+C18、C18,但相差不明显。图3是5种净化剂组合净化人参基质后净化溶液的全扫描TIC图的重叠比较。观察PSA+C18谱线的基线明显低于其他组合,而且噪声峰少,因此本实验选择PSA+C18作为人参等无颜色或者浅颜色的净化剂,而当归、枇杷叶等提取液较深的中药材需加入适量GCB。
因为中药材基质复杂,因此在不影响农药回收率的基础上,可适量增加净化剂的用量以保证样品的净化效果。
(1)PSA用量的优化:分别取PSA 50、100、150、200、250 mg,比较其用量对回收率的影响。如图4所示,随着PSA用量的增加,回收率也随之变好,但250 mg的用量反而降低了回收率。虽然150 mg和200 mg的用量均能满足回收率的要求(70% ～120% )[ 22 ],但200 mg的净化效果更好,本实验选择PSA的用量为200 mg。
(2)C18用量的优化:比较C18用量分别为50、100、150、200、250 mg对农药回收率的影响。由图4可知C18用量为150 mg和200 mg时,目标物的回收率均能满足要求。但200 mg用量的净化效果更好,本实验选择C18的用量为200 mg。
(3)GCB用量的优化:GCB的用量应根据萃取液的颜色深浅来选择。以当归为例,GCB用量大于10 mg时，随着GCB的用量增加,农药回收率呈下降趋势(见图5)。考虑到净化效果和农药回收率的双重因素,本实验选择GCB的用量为10 mg。
按照样品前处理方法的步骤做基质匹配标准溶液,在5～2000 μ g/kg 之间选择10个质量浓度点:5、20、50、100、150、200、500、1000、1500、2000 μ g/kg 分别进样检测,绘制标准曲线;以S/N=10确定定量限(LOQ)。实验结果显示相关系数(r2)均大于0.983;在人参基质中,除了乙酰甲胺磷、灭虫威、西玛津、克菌丹、异狄氏剂、异菌脲的线性范围是30～2000 μ g/kg,甲萘威、氧化乐果、喹硫磷、艾氏剂、烯丙菊酯、灭菌丹、硫丹、除尽、咪酰胺、双甲脒的线性范围是20～2000 μ g/kg,其余目标物的都为10～2000 μ g/kg;目标物的LOQ都小于残留限量标准(表略),可以满足中药材中这些农药残留的分析要求。
本文采用基质匹配标准溶液-外标法定量,在11种中药材中添加144种混合农药进行回收率试验,并用人参、西洋参、当归和黄芪空白基质分别制成20、50、200 μ g/kg 的低、中、高不同水平的加标样品溶液,按1.3和1.4节进行前处理和测定,每个水平重复4次。在人参基质中,除了乙酰甲胺磷、艾氏剂和双甲脒回收率偏低(乙酰甲胺磷73.4% ～88.2% ,艾氏剂73.1% ～88.9% ,双甲脒72.0% ～80.1% )外,其余141种目标物的平均回收率为74.3% ～111.8% ;相对标准偏差(RSD)为0.5% ～14.6%(表略)。数据说明本方法精密度高,重复性好。
为了验证方法的可靠性并使样品更好地接近实际样品的农药残留状况,特别制作模拟阳性样品人参、当归:把人参、当归磨碎,加入144种农药混合标准溶液,充分混匀,然后使溶剂全部挥发,放置7 d,得到添加量为200 μ g/kg 的模拟阳性样品。对上述样品进行检测,结果表明RSD在0.1% ～15.3%之间,回收率在46.3% ～104.8%之间(表略);其中回收率低于70%的农药数量低于检测农药总数的20% ,偏低的主要是原因是模拟阳性样品制作过程中农药吸附在制作器皿上,没有与样品完全融合;其次是制作和放置过程中,农药自身发生降解。对模拟阳性样品的检测说明本方法具有很好的准确性和适用性。
利用本方法对天津出入境检验检疫局收集的人参、西洋参、柴胡、土茯苓等中药材共34份样品进行检测。筛查出腐霉利、氟胺氰菊酯、乙拌磷等农药在上述样品中有残留(见表4)。其中有检出的样品依据GB/T 19648-2005,采用固相萃取-气相色谱-质谱(SPE-GC/MS)方法进行验证,结果见表4括号中数据,表明两种方法检测结果基本一致。
本文建立了针对中药材中144种农药残留同时筛查测定的QuEChERS-GC/MS-MS方法,扩大了QuEChERS方法在测定多种中药材农药多残留方面的应用范围。与目前常用的GC-MS方法相比,选择性好、灵敏度高。方法的定量限满足国内外相 关药典对药材中农药残留的检测要求,为中药材中 农药残留的监控、风险评估等研究提供了一种快速、高效、可靠的分析手段。
2014, Vol. 32 Issue (1): 57-68
PDF (1606KB)
2014, Vol. 32 Issue (1): 57-68
PDF (1606KB)