LC-30A超高效液相色谱仪配有二极管阵列检测器(日本岛津公司); Avanti J-26 XPI高速冷冻离心机(美国Beckman公司);分析天平XP 105(瑞士Mettler公司);振荡器SA-31(日本Yamato公司); Milli-Q Advantage A10超纯水机(美国Millipore公司); 0.22 μ m微孔尼龙膜(美国PALL公司)。

叶黄素(纯度＞ 99.0% ,美国Fluka公司)。丙酮、二氯甲烷、甲醇(色谱纯,美国J. T. Baker公司); 2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)、甲基叔丁基醚(MTBE)(纯度＞ 99.0% ,美国Sigma公司)。其他试剂均为分析纯,实验用水由美国Millipore公司超纯水仪制备;奶粉样品均购自北京当地超市。

准确称取1.0 mg(精确至0.1 mg)叶黄素标准品,用二氯甲烷溶解并定容至10 mL,配制成100 mg/L 标准储备液;准确移取标准储备液,用甲醇稀释,配制成20 mg/L 标准中间溶液,分装成若干瓶后于-80 ℃冰箱避光保存。临用前将标准中间溶液从-80 ℃冰箱取出,放至室温后用丙酮溶液(含有0.12%(质量分数，下同) BHT)稀释成20～500 μ g/L 的标准工作液。

色谱柱:YMC Carotenoid C30柱(150 mm×4.6 mm, 3 μ m);流动相:甲醇-甲基叔丁基醚(70 ∶ 30, v/v),等度洗脱;柱温:25 ℃;流速:0.5 mL/min;进样量:5 μ L;检测波长:445 nm。

准确称取约1.0 g(精确至0.001 g)乳粉样品,用5 mL温水充分溶解,加入10 mL丙酮溶液(含有0.12% BHT)和5.0 g NaCl,震荡15 min,低温离心5 min(4000 r/min, 4 ℃),取上清液至10 mL离心管中,用丙酮溶液定容,-40 ℃冷冻1 h后,再次低温(4 ℃)离心5 min。取上清液过0.22 μ m滤膜待分析。由于叶黄素遇光极易分解^{[ 14, 15, 16, 17 ]},故样品处理全过程应尽量避光。

研究表明,如果完全按照我国国家标准^{[ 7 ]}所规定的奶粉中叶黄素测定的样品处理方法来进行乳粉中叶黄素的测定,尽管样品处理方法简单,但是提取效率较差^{[ 9, 18 ]}。此外,样品提取液基质复杂,连续分析3～4个样品即会将色谱柱柱头污染而导致分离度显著下降。为了提升方法的耐用性,需要对乳粉中叶黄素的提取和净化方法进行优化。在对包括甲醇、乙腈、丙酮等多种样品提取溶剂进行比较后,发现使用丙酮可以显著提高样品中叶黄素的回收率。这也与高迎春等^{[ 19 ]}的研究结果相一致。考虑到叶黄素在提取过程中容易被氧化^{[ 20 ]},特选用含有0.12% BHT的丙酮溶液进行乳粉中叶黄素的提取,这是因为BHT作为一种抗氧化剂,可以在提取时对乳粉中的叶黄素起到保护作用^{[ 9 ]},避免乳粉中的叶黄素在提取过程中发生氧化,从而提高叶黄素的回收率。为了使乳粉中的蛋白质在提取叶黄素的过程中尽可能地沉淀完全,在提取液中添加了NaCl,借助于盐析的作用促进乳粉中蛋白质的沉淀^{[ 21 ]}。实验结果表明,使用本方法不仅获得了极高的回收率(回收率大于95% ),也使得色谱柱被污染的机率大大降低。后续的样品分析表明,使用本方法在进样次数达200次以上时,色谱柱的分离度也未见下降。

色谱柱是根据目标组分分子结构与固定相的相互作用不同来进行分离的,这使得固定相的差异会对分离产生较大影响^{[ 22 ]}。本研究分别考察了C30与C18色谱柱以及甲醇-水和甲醇-甲基叔丁基醚两种流动相体系对乳粉基质中叶黄素的分离效果。 结果表明,在甲醇-水(90 ∶ 10, v/v)流动相条件下,C18色谱柱对叶黄素有一定的分离效果,而在C30色谱柱上,叶黄素在1 h后也无法得到洗脱(见图1a);反之,当使用甲醇-甲基叔丁基醚(70 ∶ 30, v/v)为流动相时,C30色谱柱对叶黄素有较好的分离效果,而C18色谱柱则对叶黄素无保留(见图1b)。对比两种条件下的分离情况,可以看出C30色谱柱对叶黄素的分离效果及灵敏度要优于C18色谱柱。推测其原因可能是由于C30烷基的链长较C18与叶黄素的链长更相近,因此增强了二者的相互作用;此外,碳链的增长也减小了固定相的极性、增强了疏水性^{[ 23 ]},从而适宜用较强洗脱能力的流动相来进行洗脱。

图1

Fig. 1

图1 叶黄素在(a)甲醇/水体系和(b)甲醇/甲基叔丁基醚体系下分离的U-HPLC色谱图 Fig.1 U-HPLC chromatograms of lutein under the conditions of (a) methanol/water and (b) methanol/methyl tert-butyl ether as mobile phases

利用高效液相色谱法测定叶黄素的报道中所用的流动相种类很多,常用的流动相有甲醇-二氯甲烷(70 ∶ 30, v/v)^{[ 5 ]}、甲醇-甲基叔丁基醚^{[ 7, 8, 18 ]}、含2% (体积分数)水的甲醇-乙腈混合液(25 ∶ 75，v/v)和甲基叔丁基醚^{[ 9 ]}、甲醇-乙腈-氯仿^{[ 10 ]}、正己烷-乙酸乙酯(70 ∶ 30, v/v)^{[ 19 ]}等,在这些条件下为了减少分析时间,多数采用梯度洗脱,容易引起部分极性接近叶黄素的杂质混入叶黄素色谱峰中从而干扰测定;此外,每次梯度洗脱后的色谱柱平衡也需要耗费大量的时间。本研究所考察的使用甲醇-甲基叔丁基醚(70 ∶ 30, v/v)为流动相,采用等度洗脱的分离方式进行乳粉中叶黄素检测的方法目前尚未见报道。该方法的保留时间适中(5.62 min),峰形佳,可对乳粉中的叶黄素快速和高灵敏地进行检测。由于本研究所采用的是等度洗脱,因此不需要平衡时间,这使得本方法每小时至少可以分析8个样品,每天(24 h)可以对近200个样品进行检测。

一般认为提高柱温可以缩短分析物的分离时间,但是分析物的分离度可能随之下降^{[ 22, 24 ]}。考察了25、35和45 ℃ 3个温度条件下叶黄素的分离情况(见图2)。结果表明,叶黄素对分离时的温度比较敏感,随着温度的增加,叶黄素的保留时间不断缩短。但是当柱温由25 ℃增加到35 ℃和45 ℃时,可以观察到叶黄素(5.62 min,25 ℃)后面的一个干扰峰已经逐渐和叶黄素的峰发生融合,这将会对检测产生一定干扰,因此最终将分离温度确定为25 ℃。叶黄素对温度敏感的结果与已有研究结果一致^{[ 14, 15, 16, 17 ]}。

图2

Fig. 2

图2 叶黄素在不同温度条件下分离的U-HPLC色谱图 Fig.2 U-HPLC chromatograms of lutein at different temperatures

在优化的实验条件下,考察了叶黄素在20～500 μ g/L 范围内的线性关系和相关系数。结果表明叶黄素在该浓度范围内线性关系良好,线性回归方程为:y=125.564x-1067.03,相关系数(r)为0.999 9。以叶黄素标准溶液的信噪比不小于10时的进样浓度定义为定量限,得出叶黄素的定量限为20 μ g/L。这表明本方法具有较高的灵敏度,能满足婴幼儿奶粉样品中叶黄素的分析要求。

向阴性样品中添加低、中、高3个浓度水平的叶黄素标准溶液,使叶黄素含量分别为50、250、2000 μ g/kg,按1.4节样品制备方法操作,以当日的标准曲线计算样品中的含量,每个浓度水平重复测定5次,得日内精密度;连续测定3天,每天测定一次,得日间精密度,结果见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 叶黄素的加标回收率及精密度 Table 1 Recoveries and precisions (RSDs) of lutein Spiked/( μ g/kg) Recovery/% RSD/% Intra-day (n=5) Inter-day (n=3) 50 97.9 1.07 1.22 250 100.2 2.04 2.79 2000 104.4 2.36 3.86

表1 叶黄素的加标回收率及精密度 Table 1 Recoveries and precisions (RSDs) of lutein

表1表明叶黄素的回收率为97.9% ～104.4% ,日内相对标准偏差(RSD)为1.07% ～2.36% ,日间RSD为1.22% ～3.86% 。

目前市场上的婴幼儿奶粉中叶黄素的标示值多在500～2430 μ g/kg (50～243 μ g/100 g)之间。采用本文方法对购自市场不同品牌的10种乳粉进行了测定。结果表明,婴幼儿奶粉中叶黄素的添加量均达到了标示值,而在成年人奶粉中未检测到叶黄素。图3即为典型婴幼儿奶粉样品的色谱图。

图3

Fig. 3

图3 婴幼儿奶粉样品中叶黄素的色谱图 Fig.3 U-HPLC chromatogram of lutein in a real infant milk powder sample