高效液相色谱设备:LC-20AB泵;CBA-20A控制器;SPD-M20A DAD检测器(Shimadzu,Kyoto,Japan);进样阀:7725i(Rheodyne,USA);定量阀:20 μ L。商品化搅拌棒(PDMS-SBSE):涂层材料为PDMS,棒长20 mm,涂层厚度1.0 mm(Twister; Gerstel,Müllheim a/d Ruhr; Germany)。自制的基于整体材料的SBSE包括VIDB-SBSE(以聚(N-乙烯基咪唑-二乙烯基苯)整体材料为涂层^{[ 12 ]})、VPDB-SBSE(以聚(N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯)整体材料为涂层^{[ 14 ]})、VPDE-SBSE(以聚(N-乙烯基吡啶-乙二醇二甲基丙烯酸酯)整体材料为涂层^{[ 15 ]})和VPDP-SBSE(以聚(N-乙烯基邻苯亚胺-N,N-二甲基双丙烯酰胺)整体材料为涂层^{[ 16 ]})。这4种SBSE的棒长均为30 mm,涂层厚度均为1.0 mm。

FZD、NFT和NFZ标准品均购自Sigma公司;乙腈(ACN)和甲醇(色谱纯)购自Tedia公司(Fairfield,USA);全部实验用水均为超纯水(Millipore,Bedford,MA,USA)。

分别称取2.5 mg各标准样品,以甲醇溶解并定容于25 mL棕色瓶中,配制成100 mg/L 的单标准储备液,置于4 ℃的冰箱中保存。使用时,用甲醇为稀释液,取各单标准储备液适量,用稀释液配制成所需浓度的混合标准溶液。

饲料样品购自厦门市场;实际水样采自厦门淡水养殖场,置于冰箱冷藏待用。

色谱分离柱:Kromasil LC-18柱(250 mm×4.6 mm,5 μ m);流动相:水/乙腈(体积比为75 ∶ 25)二元溶液;流速:1.0 mL/min;检测波长:366 nm;进样体积:20 μ L。

饲料样品:准确称取1.0 g样品于离心管中,加入2.5 mL乙腈,漩涡振荡混匀5 min,然后超声提取5 min,高速离心10 min,取上清液。用2.5 mL乙腈再重复提取一次,合并两次提取液。取1.0 mL提取液于250 mL烧杯中,加入99 mL水,将溶液pH值调到10.0，并加入15% (质量分数)的NaCl。放入搅拌棒以300 r/min 的速度进行搅拌萃取2.0 h。萃取完成后,取出搅拌棒,将其放置于3.0 mL乙腈中,在同样的搅拌速度下解吸1.5 h,解吸液直接进行色谱分析。

实际水样:将水样过0.45 μ m滤膜,然后取100 mL滤液于250 mL烧杯中,余下步骤(调pH,加入NaCl,萃取,解吸)同饲料样品的处理。

根据文献^{[ 17 ]},FZD、NFT和NFZ的K_MC/W计算如方程(1)所示。

在SBSE过程中,萃取和解吸时间、样品基底pH值和离子强度对目标物的富集性能有较大影响。为了得到VIDB-SBSE对3种NFA的最佳萃取条件,本研究对上述萃取条件进行了详细优化。

2.1.1 萃取和解吸时间的优化

图1为萃取时间对萃取效率的影响。由图1可见,在其他实验条件保持不变时,萃取时间在0.5～2.0 h之间时,随着萃取时间的增加,VIDB-SBSE对3种目标物的萃取量逐渐增大,在2.0 h时,吸附达到平衡。因此,实验中选择2.0 h为最佳萃取时间。解吸时间对实验结果也有较大影响。本研究考察了解吸时间在15～120 min之间时解吸效果的变化,实验结果表明在90 m

图 1萃取时间对萃取效率的影响 Fig. 1 Effect of extraction time on extraction efficiency Conditions: desorption time was 1.0 h; the pH value of sample matrix was unadjusted; no salt was added; the spiked concentration of each analyte was 50 μ g/L.

2.1.2 pH值的影响

由于硝基呋喃类药物分子结构中含有丰富的氮原子,同时整体材料结构中存在着咪唑基团,因此样品基底pH值会影响NFA和咪唑基团的存在形式,从而影响VIDB-SBSE对NFA的萃取性能。在其他实验参数不变的条件下,基底pH值从2.0增加到12.0,其对萃取效率的影响如图2所示。从图2中可以看出,当pH值较低时,VIDB-SBSE主要通过疏水作用对NFA进行吸附,但此时NFA和整体材料的咪唑基团中的氮原子均被质子化而产生电荷排斥作用,因而减弱了VIDB-SBSE对目标物的吸附能力。随着pH值的升高,质子化程度减弱,电荷排斥作用减小,因此萃取性能提高。随着pH值的继续增加,氮原子完全去质子化,此时除了疏水作用外,咪唑基团和NFA还存在着氢键和偶极-偶极作用,在多重作用力下,VIDB-SBSE对NFA的萃取能力进一步增强。但当pH提高到10以上时,溶液中过多的OH^-严重削弱了氢键和偶极-偶极作用,导致萃取性能下降。根据实验结果,选择10.0为最优pH值。

图 2样品pH值对萃取效率的影响 Fig. 2 Effect of pH value of sample matrix on extraction efficiency Conditions: extraction and desorption times were 2.0 h and 1.5 h,respectively; no salt was added; the spiked concentration of each analyte was 50 μ g/L,and the sample pH values were adjusted by 0.1 mol/L HCl or 0.1 mol/L NaOH. The symbols are the same as in Fig.1.

2.1.3 离子强度的影响

根据文献^{[ 14,15,16,17 ]},对于极性化合物的萃取,由于存在盐析作用及静电相互作用,因此离子强度对萃取效率有很大影响。本实验通过添加不同量的NaCl来改变基底的离子强度,添加量从0到35%(质量分数)(0、5% 、10% 、15% 、20% 、25% 、30%和35% )。从图3可以看出,当NaCl含量为15%时,VIDB-SBSE对目标物的萃取性能均达到最大值,因此选择15%为最佳的NaCl添加量。

图 3 离子强度对萃取效率的影响 Fig. 3 Effect of ionic strength in sample matrix on extraction efficiency Conditions: pH value was adjusted to 10.0. The other conditions were the same as in Fig. 2.

综合实验结果,VIDB-SBSE对3种NFA的最佳萃取条件为:吸附2.0 h,解吸1.5 h,基底pH值调为10.0,NaCl的含量为15% 。

在最佳萃取条件下,VIDB-SBSE对FZD、NFT和NFZ显示出理想的萃取性能。从图4可以看出,与加标水样富集前(图4a)相比,经过VIDB-SBSE富集后,3种目标物的色谱峰明显增高(图4c),VIDB-SBSE对FZD、NFT和NFZ的富集效率分别为76.5% 、82.2%和80.1% ,而商品化的PDMS-SBSE 则对目标物没有富集效果(图4b)。

图 4 3种硝基呋喃类药物经VIDB-SBSE和PDMS-SBSE 萃取后的色谱图 Fig. 4 Chromatograms of FZD,NFT and NFZ after enrichment with VIDB-SBSE and PDMS-SBSEa. direct injection of spiked water sample with each analyte at 50 μ g/L; b. spiked water sample with each analyte at 50 μ g/L and treated with PDMS-SBSE; c. spiked water sample with each analyte at 50 μ g/L and treated with VIDB-SBSE.

图 5 不同SBSEMs富集3种硝基呋喃类药物后的色谱图图 Fig. 5 Chromatograms of FZD,NFT and NFZ after enrichment with different SBSEMs

表 1 呋喃唑酮、呋喃妥因和呋喃西林在不同SBSEMs上的分配系数 Table 1 Distribution coefficients (K) of FZD,NFT and NFZ on different SBSEMs Compound logKVIDB/W logKVPDB/W logKVPDE/W logKVPDP/W logKPDMS/W FZD 2.56 2.32 2.01 1.59 -0.04 NFT 3.12 3.55 2.64 1.98 -0.47 NFZ 2.88 2.66 2.31 1.76 0.23

表 1呋喃唑酮、呋喃妥因和呋喃西林在不同SBSEMs上的分配系数 Table 1 Distribution coefficients (K) of FZD,NFT and NFZ on different SBSEMs

用标准储备液配制不同浓度梯度的溶液,在最佳萃取条件下,考察方法的线性范围、相关系数、检出限、定量限及日内和日间重复性,结果见表2。

表 2 3种NFA的线性范围、线性相关系数(R2)、检出限、定量限、萃取效率及日内和日间重复性 Table 2 Linear ranges,correlation coefficients (R2),LODs and LOQs,extraction efficiencies,inter-day and intra-day precisions achieved for the three NFA Compound Linear range/ (μg/L) R2 LODa)/ (μg/L) LOQb)/ (μg/L) Extraction efficiency/% RSDs/% Intra-dayc)(N=3) Inter-dayc) (N=4) FZD 0.5-200 0.9992 0.11 0.36 88.6 3.56 4.05 NFT 0.25-200 0.9947 0.068 0.22 75.5 2.13 5.01 NFZ 0.25-200 0.9990 0.074 0.24 90.8 3.28 5.23 a) S/N=3; b) S/N=10; c) assays at 50 μ g/L level.

表 23种NFA的线性范围、线性相关系数(R2)、检出限、定量限、萃取效率及日内和日间重复性 Table 2 Linear ranges,correlation coefficients (R2),LODs and LOQs,extraction efficiencies,inter-day and intra-day precisions achieved for the three NFA

从表2中的数据可知,呋喃唑酮的线性范围为0.5～200 μ g/L,呋喃妥因和呋喃西林的线性范围为0.25～200 μ g/L,3种目标化合物均具有良好的线性关系(R²＞0.99)。同时研究取得了与MS检测^{[ 18,19 ]}在同一级别的灵敏度,其LOD在0.068～0.11 μ g/L 之间,LOQ在0.22～0.36 μ g/L 之间,所建方法的日内和日间的实验重复性良好(RSD＜6% )。表明本方法具有较高的灵敏度和重复性。

将所建的VIDB-SBSE-HPLC-DAD方法用于饲料和实际水样中NFA的测定,其结果如表3所示。结果表明,在一个水样中测得低浓度的NFT,而饲料样品均未检出NFA。实际样品中复杂基底可能对萃取效率产生影响,为了考察所建立的方法用于实际样品中3种NFA物质测定的可行性,测定了饲料和实际水样中不同加标量的回收率。从表3可以看出,对于两种不同质量浓度加标量(5.0和100μg/L),在不同饲料和水样中均取得了理想的回收率,3种目标物的回收率在80.6% ～108%之间。同时实验重现性良好,所有RSD值均小于10% 。