选用Symmetry C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μ m,10 nm)。流动相A相为乙腈-水(2 ∶ 98,v/v)(用氨水调pH等于10.0),B相为乙腈-水(98 ∶ 2,v/v)(用氨水调pH等于10.0)。梯度洗脱程序如下:初始B相为5% ,在5 min内升至8% ,在35 min内从8%升至18% ,在22 min内从18%升至32% ,在2 min内从32%陡增至95%并保持4 min,最后在4 min内从95%降至5% 。将Ⅰ和Ⅱ两份样品分别按时间分布收集65个馏分(每1 min收集一个馏分),冻干,之后再按顺序每11份(最后一组为10份)合并成6个馏分准备进行第二维分离。

选用Aquasil C18色谱柱(50 cm×75 μ m,2 μ m)。流动相A相为2%的乙腈与98%的水(含0.1% TFA),B相为98%的乙腈与2%的水(含0.1% TFA)。梯度洗脱程序如下:初始B相为0,在30 min内从0升至10% ,在210 min内从10%升至20% ,在100 min内从20%升至35% ,在5 min内从35%升至80% ,在80%保持10 min,最后在5 min内从80%降至0,并且保持40 min。

喷针外加电压选用2.3 kV;扫描范围为m/z 350～1500 的全扫描,扫描方式为高分辨模式(high resolution);串级质谱扫描范围为m/z 100～1250、扫描模式为信息依赖性获取模式(IDA,information dependent acquisition)。

谱图校正的目标是在信号噪声中,将不同实验中存在保留时间偏移、但具有相同特征的肽段流出峰对齐。自1998年以来,谱图校正对齐的研究报道已有过不少,Nielsen等^{[ 3 ]}首先建立了一套相关优化规整算法(COW,correlated optimized warping algorithm),随后Wang等^{[ 4 ]}在此基础上研究了动态时间规整算法(DTW,dynamic time warping algorithm),此外,还有如May等^{[ 5 ]}编写的msInspect、Li等^{[ 6 ]}与Fugmann等^{[ 7 ]}编写的SpecArray以及Katajamaa等^{[ 8 ]}编写的MZmine等软件可以进行谱图校正对齐。

概括起来,可以把这些校正方法归为两类。第一类方法是在特征峰检测前对原始数据进行校正对齐,这类方法通过计算理想曲线方程将一次实验的色谱保留时间对齐至另一次实验。然而,曲线方程将整个色谱中的保留时间差异一齐纳入了计算,因此,该方法并不能保证将单个肽段进行校正对齐。第二类方法则是利用检测完的特征峰列表进行校正对齐,并且允许个别肽段存在一定范围的保留时间差异。但是,这类方法依赖于对特征峰的预先检测,而且无法利用原始谱图数据的信息,因此特征峰检测出现的错误会直接影响到整个谱图的校正与对齐。总之,这两类方法均只能用于相似度比较高的数据之间,而对于不同的样品很有可能会出现错误,比如比较正常和癌变组织蛋白质的实验中。

由于第二类方法需要事先进行特征峰的检测,会在谱图校正前引入额外的影响因素,因此,我们在第一类方法中选择合适的算法并做进一步研究。研究的内容主要是从第一类方法中筛选出合适的算法,并挑选和利用现有的软件进行改进,以符合预期的校正功能。

上文提到的第一类方法,主要有秩最小化规整^{[ 9 ]}、抽象子空间差异规整^{[ 10 ]}、动态时间规整^{[ 11 ]}、参数时间规整^{[ 12 ]}以及相关性优化规整等。一直以来,这些方法只是在一般有机物的色谱鉴定中使用,无法直接运用于蛋白质组学的实验中。

当比较两次LC/MS实验谱图时,Fischer等^{[ 13 ]}并没有直接将两次谱图发生的保留时间偏移进行校正对齐,而是选择以其中一次实验的保留时间作为函数的自变量,将两次实验谱图的保留时间差值作为因变量,再进行校正处理。由于计算量过于庞大,Fischer等开始并没有将所有的数据进行校正,只是选取了一些可以得到鉴定的肽段流出峰。随后,该方法被广泛用于色谱-质谱联用数据的校正^{[ 14,15 ]},并且为后续的定性定量处理提供帮助。

2008年以来,Christin等^{[ 16 ]}认为基于总离子流(TIC)图的保留时间校正方法只运用了保留时间一维信息,并没有考虑到LC-MS数据中不同m/z信号对总离子流图的贡献,他们认为用于LC-MS数据时间漂移校正的方法应该对每一个有贡献的m/z响应进行校正。然而,对于特定的一个色谱流出时间点,其对应的m/z响应信号有很多个,而其中真正的目标分析物信号却只占小部分,因此,在运用校正方法之前,必须对这些质谱信号进行筛选,选择出高质量的质谱信号后再进行校正。为此,“组分检测算法”^{[ 17 ]}的变量选择方法被运用到对质谱数据的筛选中。该算法具有计算时间快,对色谱峰形影响小等特点,与色谱领域所运用的DTW、PTW和COW算法相结合,可广泛用于蛋白质组学LC-MS的时间漂移校正。

结合前文总结的两类校正方法的特点,本文最终选用Progenesis LC-MS软件的算法,筛选出大量不同的色谱峰,并对所有色谱峰进行校正,之后,从对齐的多次实验色谱图中再次检测特征峰,并生成可用于搜库的.mgf文件。通过Mascot软件完成搜库后,再将获得的.xml文件导入Progenesis LC-MS软件,进行后续的分析处理。

除了上文提到的以及我们最终选用的方法外,Aebersold等^{[ 18 ]}与Escher等^{[ 19 ]}采用iRT(i-rentention time)的方法进行了校正。他们选取了一系列被称为iRT肽段的标准肽段(见表2)作为参照加入实验样品中,以此对样品肽段流出峰进行校正。 对于在两个iRT肽段间流出的肽段x,其iRT值计算方法为:iRT_x=[(RT_x-RT₁)/(RT₂-RT₁)]×100。

表 2 iRT肽段的序列与对应iRT值 Table 2 iRT-peptide sequences and corresponding iRT values Sequence of iRT-peptide Name iRT value LGGNEQVTR iRT-pep a -24.92 GAGSSEPVTGLDAK iRT-pep b 0.00* VEATFGVDESNAK iRT-pep c 12.39 YILAGVENSK iRT-pep d 19.79 TPVISGGPYEYR iRT-pep e 28.71 TPVITGAPYEYR iRT-pep f 33.38 DGLDAASYYAPVR iRT-pep g 42.26 ADVTPADFSEWSK iRT-pep h 54.62 GTFIIDPGGVIR iRT-pep i 70.52 GTFIIDPAAVIR iRT-pep k 87.23 LFLQFGAQGSPFLK iRT-pep l 100.00* * defined fix-points for the iRT-C18 scale.

表 2 iRT肽段的序列与对应iRT值 Table 2 iRT-peptide sequences and corresponding iRT values

同一条肽段在不同实验中经过换算后得到的iRT值是相同的,那么,只要选定一次实验的保留时间计算得到该肽段的iRT值,其他实验中的该肽段流出峰保留时间就可以匹配上去,最终达到校正和对齐的效果。但是,由于11条iRT肽段将色谱图分割成了10个区间,导致谱图的校正对齐必须在分割后的区域内分别完成,因此,我们最终并没有选择该方法。事实上,iRT的方法在很多时候都被用于保留时间的预测以及质谱多反应检测(MRM)中。

本文中,我们首先对样品Ⅰ和样品Ⅱ的各6个馏分分别进行第二维反相色谱分离,再进入质谱,连续进行三次串级扫描,共计得到36个.wiff文件,总大小约400 G。进而,我们选取样品Ⅰ的第四馏分进行了预校正分析。

对于任何一次HPLC-MS/MS实验数据,都可以得到一系列可视化图(如图1)。图1a的横坐标与纵坐标分别为m/z值与保留时间,图中点的颜色深浅代表对应的m/z与保留时间的色谱峰强度;图1b为最常见的总离子流图。我们将样品Ⅰ第四馏 分的3次重复进样结果作了校正计算,图2为样品Ⅰ第四馏分的第二次与第三次重复进样谱图校正前后的情况。从图中可以看出,几乎所有的流出峰都得到了比较良好的校正与对齐(见图2b)。

图 1 样品Ⅰ第四馏分第二次进样的(a)离子强度图与 (b)总离子流图 Fig. 1 a) Ion intensity map and (b) total ion chromatogram of the 2nd injection for the 4th fraction of sample Ⅰ

图 2 样品Ⅰ第四馏分第二次进样与第三次进样(a)校正前与 (b)校正后的总离子流图比较 Fig. 2 Comparison of total ion chromatograms of the 2nd and the 3rd injections for the 4th fraction of sample Ⅰ (a) before alignment and (b) after alignment

将3次重复实验的谱图进行校正对齐后,我们分别计算了它们之间的谱图相似率(见表3)。由预校正相似率结果可知,在谱图校正方面,我们采用的策略是可行的。因此,我们将该方法运用到了两个样品(Ⅰ和Ⅱ)总共12个馏分的36次实验数据的批量处理中。

表 3 样品Ⅰ第四馏分3次重复进样之间的谱图相似率 Table 3 Similarities among three repeat injections of the 4th fraction in sample Ⅰ Ⅰ-4-R1 Ⅰ-4-R2 Ⅰ-4-R3 Ⅰ-4-R1 86.0% 87.9% Ⅰ-4-R2 83.4% Ⅰ-4-R3 R represents repeat injection.

表 3 样品Ⅰ第四馏分3次重复进样之间的谱图相似率 Table 3 Similarities among three repeat injections of the 4th fraction in sample Ⅰ

在样品处理过程中,我们在两种不同药物刺激的HUVEC样品中等量加入了QconCAT标准蛋白质。因此,可以通过对QconCAT标准蛋白质的鉴定来考察谱图校正的情况。

将校正后的谱图文件导出为.mgf文件,然后,使用Mascot软件进行MS/MS搜索,使用QconCAT标准蛋白库,肽段误差允许为10 ppm,串级质谱误差允许为1 Da。将搜库结果生成.xml文件,并导入Progenesis LC/MS软件,该软件将自动参考谱图搜索结果把谱图文件中的已鉴定肽段流出峰挑选出并生成列表。

最后,我们将样品Ⅰ和Ⅱ各6个馏分的处理结果按照不同的重复次数进行合并,得到了样品Ⅰ及样品Ⅱ总鉴定QconCAT标准蛋白质数的3次重复文件,分别标记为Ⅰ-R1、Ⅰ-R2、Ⅰ-R3、Ⅱ-R1、Ⅱ-R2和Ⅱ-R3。对于这6个新生成的文件,我们将它们各自鉴定到的QconCAT标准蛋白质作图进行两两比较,对作比较的两个文件中鉴定到的标准蛋白质的保留时间进行线性拟合处理,得到相关系数(R)。

通过相关系数的“热图”可以直观地发现:两种不同药物刺激的样品中,鉴定到的QconCAT标准蛋白质的相关系数在0.9附近,而同一样品的重复进样之间相关系数都在0.98以上(见图3)。推测造成这种结果的原因,主要为DMSO和MLN两种不同的刺激使得HUVEC细胞内的蛋白质发生了变化,而在不同的复杂体系背景下,蛋白质的酶解肽段之间会发生互相干扰,影响到保留时间甚至是峰强度。因此,依靠谱图校正的方法,我们在今后的研究中将会把肽段互相影响的因素作为研究方向。

图 3 样品Ⅰ和Ⅱ所有重复实验中QconCAT标准蛋白质鉴定的相关系数的热图 Fig. 3 Thermograph for correlation coefficients of identified QconCAT standard proteins among three repeat injections of sampleⅠand Ⅱ

最后,我们将校正前后的实验数据在Mascot软件中重新进行了搜库,使用Swissprot标准蛋白库,肽段误差允许为10 ppm,串级质谱误差允许为1 Da。对未进行谱图校正而直接进行搜库的结果统计处理后,显示从DMSO处理的HUVEC细胞中鉴定到了 6535 个蛋白质,从MLN处理的HUVEC细胞中鉴定到了 6925 个蛋白质。

经过谱图校正之后,DMSO和MLN处理的HUVEC细胞分别鉴定到了 8089 个和 8094 个蛋白质(见图4)。蛋白质的鉴定数量平均提高了近 1000 个左右,说明我们的校正方法可以提高复杂体系中蛋白质的鉴定率。

图 4 谱图经校正后的DMSO与MLN刺激的HUVEC细胞内蛋白质鉴定结果 Fig. 4 Protein identification results in HUVEC treated with DMSO and MLN after spectrum alignment

此外,我们还对DMSO和MLN刺激的HUVEC细胞内蛋白质进行了依靠谱图计数的相对定量分析^{[ 20,21 ]},在DMSO刺激的HUVEC细胞中得到了 6308 个蛋白质,而MLN刺激的细胞中得到了 6873 个蛋白质,我们以两倍比值差异进行了两个组分的差异分析,相比于DMSO刺激的细胞,MLN刺激的HUVEC细胞中有930个蛋白质上调,274个蛋白质下调(见图5)。

图 5 DMSO和MLN刺激导致的HUVEC细胞内蛋白质的差异 Fig. 5 Differential expression of proteins in HUVEC treated with DMSO or MLN