明尼苏达大学Distefano教授和Wagner教授两个研究小组合作,发展出一种新颖的蛋白质同时双重标记方法(见图1)。他们利用法尼酰基转移酶(farnesyl transferase),将一种独特的三元正交试剂,转移到C端含有易于添加的CaaX序列盒的蛋白质上,从而可实现蛋白质的同时双重标记(Rashidian M., Kumarapperuma S. C., Gabrielse K., Fegan A., Wagner C. R., Distefano M. D. Simultaneous dual protein labeling using a triorthogonal reagent. J. Am. Chem. Soc., dx.doi.org/10.1021/ja403813b)。

图1

Fig. 1

图1 蛋白质的同时双重标记

为了实现双重标记,他们首先设计并合成出一种特殊的三元正交试剂1(见图2)。这种三元正交试剂含有一个可作为法尼酰基转移酶底物的烯丙基二磷酸酯以及一个炔基和一个醛基。经分子对接模拟证实,所设计的三元正交试剂仍保留法尼酰基转移酶底物的特性,可嵌入法尼酰基转移酶活性中心,并且其构象与天然底物类似。利用一个模型多肽(N-丹酰化的GCVIA,其中CVIA是CaaX盒序列的一种),他们证明了所设计的三元正交试剂可作为法尼酰基转移酶的替代底物,能转移到含CaaX盒的多肽上。

图2

Fig. 2

图2 三元正交试剂１

已经知道,含醛基的绿色荧光蛋白质（green fluorescent protein, GFP）和含炔烃的GFP可分别通过肟连接和点击反应实现进一步修饰。Distefano教授和Wagner教授利用所设计的三元正交试剂1,可将法尼酰基化的蛋白质同时进行肟连接和点击反应。而单独的肟连接或点击反应实验表明,二者不会相互干扰。1 h内可实现彻底的肟连接产物转化。而12 h的点击反应可实现＞80%的转化。一般而言,肟连接比点击反应的效率更高。

为了展示这一方法的可行性和应用性,他们首先利用合成的三元正交试剂修饰一种蛋白质,然后通过肟连接和点击反应,同时将一个含叠氮基的四甲基罗丹明荧光染料和一个含氨基的PEG(polyethylene glycol)键入蛋白质,并将这一同时双重标记方法应用于一种模型蛋白质(绿色荧光蛋白质)和一种具有重要治疗价值的蛋白质(睫状节神经细胞营养因子)。另外,他们利用设计的三元正交试剂修饰蛋白质,与双氨甲喋呤二聚体及氨基化的四甲基罗丹明荧光染料同时偶联。在这些工作的基础上,可构建蛋白质组装体。

以上简要介绍的三元正交工作是生物正交化学研究最新的代表。经过十年的发展,生物正交化学方法已可应用于蛋白质的位点特异性修饰和它们的特性和功能研究。具体内容可参阅本文第一段所提供的文献,而相关工作也可参阅该论文所引用的文献。

以上介绍的工作主要是针对生物治疗而开展的,属于化学和分子生物学交叉研究方向。但是,我们色谱分离分析工作者是否能从中受到一定程度的启发?

目前,蛋白质亲和色谱在生命科学中具有很多的实际应用,但也面临着许多挑战。例如,一般化学固定方法是随机地与蛋白质各个位置的氨基或羧基反应,可能会破坏蛋白质的天然结构或其功能,并且反应的计量难以控制。因此蛋白质的定向固定化是一种较为理想的选择。但是,如何实现蛋白质稳定、持久的定向固定化?固定在非生理表面的蛋白质易于丧失其天然结构,从而失去其特有的生理功能。如何在色谱填料表面维持固定化后蛋白质的生理功能?

另外,细胞内许多蛋白质是以复合物乃至复杂的组装体形式存在,是否可以将蛋白质的复合物或组装体实现定向固定化?

对于酶的固定化也存在以上的问题。但是,在许多具体酶应用例子中,需要多种酶的参与。因此,需要发展同时固定多种酶的方法也是色谱研究的重要内容。但如何实现多种酶的同时、可控的固定化仍是一个难题。

我在这里介绍的三元正交概念以及蛋白质同时双重标记方法也许会对以上问题的解决提供一种新的思路。

另外,可以预期,三元正交试剂和同时双重标记在蛋白质组学的研究中也会有新的应用。