整体柱固相萃取-高效液相色谱法在线分析水果中的氯吡脲


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	罗伟强

	肖小华

	杜卓

	李攻科

罗伟强^1,2, 肖小华¹ , 杜卓¹, 李攻科¹

1. 中山大学化学与化学工程学院, 广东广州 510275;
2. 广西民族大学化学化工学院, 广西南宁 530006

收稿日期：2013-11-5

基金项目：国家自然科学基金项目（21127008）；高等学校博士学科点专项（20120171110001）；广州市科技计划项目（12A102051514）.

通讯作者：E-mail:xiaoxhua@ mail.sysu.edu.cn(肖小华);E-mail:cesgkl@ mail.sysu.edu.cn(李攻科).

摘要：建立了整体柱固相萃取-高效液相色谱/紫外检测在线联用方法并用于水果中氯吡脲的分析测定。考察了萃取溶剂的pH值及其流速、溶剂解吸时间及其流速等因素对氯吡脲萃取率的影响。在优化的条件下，该方法对氯吡脲的富集倍数为214倍，方法的线性范围为0.01~50.00 μg/L，检出限为25 ng/L，相对标准偏差（RSD）为3.9%。黑葡萄、猕猴桃和西瓜等水果中氯吡脲的加标回收率为87.0%~120.7%，RSD为0.6%~9.2%。结果表明该方法快速、灵敏，能满足水果中痕量氯吡脲残留分析的要求。

关键词：整体柱固相萃取高效液相色谱在线分析氯吡脲水果

Monolith column solid-phase extraction coupled with high performance liquid chromatography in online mode for the determination of forchlorfenuron in fruits

LUO Weiqiang^1,2, XIAO Xiaohua¹ , DU Zhuo¹, LI Gongke¹

1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China;
2. College of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi University for Nationalities, Nanning 530006, China

Received: 2013-11-5

Corresponding author：E-mail:xiaoxhua@ mail.sysu.edu.cn(XIAO Xiaohua);E-mail:cesgkl@ mail.sysu.edu.cn(LI Gongke).

Abstract: A novel method based on the monolithic column solid-phase extraction (SPE) coupled with high performance liquid chromatography in online mode was developed for the determination of trace forchlorfenuron in fruits. The enrichment factor of SPE for forchlorfenuron was 214. The method was fully validated. It showed a linear range of 0.01-50.00 μg/L and a limit of detection of 25 ng/L, with the relative standard deviation (RSD) of 3.9%. The proposed method was successfully applied for the determination of forchlorfenuron in grape, kiwifruit and watermelon samples, with the recoveries of 87.0%-120.7% and the RSDs of 0.6%-9.2%. This online method was proved to be selective, sensitive and convenient for the determination of trace forchlorfenuron in complex samples.

Key words: monolith column solid-phase extraction high performance liquid chromatography (HPLC) online analysis forchlorfenuron fruits

氯吡脲(forchlorfenuron,CPPU)又名调吡脲,化学名称为1-(2-氯-4-吡啶基)-3-苯基脲,是一种广泛应用于农业生产的新型高效植物生长调节剂。由于长期接触CPPU会引起体内蛋白质代谢的紊乱、肺气肿和体形消瘦,欧盟、日本、美国等已对其残留量进行严格限制,不同作物中CPPU最大残留限量(MRL)为10～100 μ g/kg^{[ 1,2 ]}。我国规定西瓜和黄瓜中CPPU的MRL为0.1 mg/kg,而猕猴桃和葡萄中为0.05 mg/kg。目前,国内外对CPPU残留分析的研究主要包括溶剂萃取^{[ 3 ]}、固相萃取^{[ 4,5,6,7 ]}等有效的样品前处理方法,以及灵敏的气(液)相色谱-质谱联用^{[ 8 ]}、液相色谱^{[ 9 ]}、放射免疫方法^{[ 10 ]}等分析方法。由于蔬果中CPPU残留含量通常很低,样品基质和待测组分具有不确定性等因素的影响,其分析检测要求具有精细的操作手段、较高的灵敏度和较强的特异性。现有的离线样品处理与色谱分析等方法存在样品易受污染、损失以及分析灵敏度不高等缺点,难以满足复杂基体中痕量CPPU残留的分析要求。

有机聚合物整体柱具有单体多元化且易得、易制备、易被修饰、通透性和耐溶剂性能好等优点,在整体柱的制备及应用中备受青睐,已成功地应用在食品、环境、催化、生物等众多领域中^{[ 11,12 ]};另外,整体柱也可作为色谱分离柱使用,实现复杂基体中痕量分析物的快速检测和快速分离^{[ 13 ]}。不锈钢基质的硬度高、尺寸均一,可以避免玻璃毛细管整体柱易折断的现象,适合作为整体柱管材^{[ 14 ]}。目前不锈钢管整体柱前处理技术在蔬果样品CPPU在线分析中的应用还未见报道。

本文制备了不锈钢管基材的固相萃取整体柱,结合HPLC/UV建立了整体柱固相萃取-HPLC在线联用方法。考察了萃取溶剂的pH值及其流速、溶剂解吸时间及其流速等因素对CPPU萃取率的影响,并用于水果中CPPU的在线分析检测。

1 实验部分

1.1 仪器、材料和试剂

1.1.1 仪器

LC-10Avp高效液相色谱仪(Shimadzu,日本),Cary100紫外光谱仪(Varian,美国),红外光谱仪Thermo Scientific Nicolet 330,Hitachi 4300冷场电子扫描显微镜(SEM) (Hitachi,日本),Diamonsil (TM)钻石C₁₈色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μ m,Dikma),离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司),超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司),冰箱(-20 ℃,青岛海尔公司),分析天平(0.1 mg,梅特勒-托利多公司),涡旋机(上海精科仪器有限公司)。

1.1.2 材料

黑葡萄、猕猴桃和西瓜等样品购于中山大学农贸市场。样品新鲜,表面无虫害,冷藏保鲜。对易腐坏的样品需冷冻保存,测定时避免反复解冻。

1.1.3 试剂

甲基丙烯酸(MAA)、偶氮二异丁腈(AIBN)、聚乙二醇-6000(PEG-6000)均购自天津大茂化学试剂厂;乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)购自广州千湖贸易有限公司。甲醇、乙腈、乙酸均为色谱纯;二氯甲烷为分析纯。氯吡脲标准品(纯度98.0% )购于北京百灵威公司。水为纯净水(深圳怡宝食品饮料有限公司)。

CPPU标准溶液(200.0 mg/L):称取20.0 mg氯吡脲标准品,用甲醇定容到100 mL容量瓶中,置于-20 ℃冰箱中保存。

1.2 不锈钢管固相萃取整体柱的制备与表征

1.2.1 不锈钢管的预处理

内径1.2 mm的不锈钢管先用1 mol/L NaOH溶液浸泡1 h,再用1 mol/L 的HCl溶液浸泡1 h,然后用超纯水清洗并于120 ℃干燥1 h，待用。

1.2.2 甲基丙烯酸-二甲基丙烯酸乙二醇酯(MAA-co-EGDMA)整体柱(50 mm×1.2 mm)的制备

参照文献^{[ 15 ]}方法,将功能单体MAA 47 μ L、交联剂EGDMA 400 μ L、PEG-6000 160 mg、致孔剂甲醇 1100 μ L和引发剂AIBN 4.5 mg混合均匀并超声10 min得到预聚液;将预聚液注入已处理的不锈钢管中,用硅橡胶封堵两端并在60 ℃下反应24 h。待反应完成后,将整体柱中的致孔剂及未反应的试剂用甲醇冲洗除去。将整体柱截成50 mm左右长度保存待用。

1.2.3 MAA-co-EGDMA整体柱的表征

采用冷场电子扫描显微镜观察不锈钢管整体柱截面结构及形貌特征;通过萃取量计算表征其萃取性能，通过流速与压力关系表征其通透性。其中,萃取量N的计算公式为:

式(1)中,N为目标物的萃取量,A为目标物在整体柱-HPLC在线分析时的色谱峰面积,a₁及b₁分别为氯吡脲采用直接进样分析时进样量(ng)与峰面积线性方程的斜率及截距。

1.3 样品分析

准确称取切碎的水果样品2.0 g置于50 mL具塞离心管中,加入10 mL乙腈涡旋振荡萃取4 min,再超声波辅助萃取10 min;重复萃取1次,合并2次萃取液于离心管中,以 4000 r/min 离心10 min。将上层清液置于125 mL分液漏斗中,加入10 mL水和4.8 mL二氯甲烷,强烈振荡，收集上层有机相并浓缩至干,残留物用20.00 mL甲醇-水溶液(1 ∶ 99,v/v)复溶,过0.45 μ m滤膜,制得样品溶液。将样品溶液引入整体柱后，以甲醇-水(1 ∶ 99,v/v)为溶剂,以0.8 mL/min速率进行萃取；然后用0.4 mL 乙腈-0.2%乙酸水溶液(50 ∶ 50,v/v)为溶剂解吸，解吸液在线转入HPLC中进行分析。HPLC条件:色谱柱为Diamonsil C₁₈ (250 mm×4.6 mm,5 μ m)。流动相为乙腈-0.2%乙酸水溶液(50 ∶ 50,v/v),流速为1.0 mL/min,检测波长为261 nm。

水果中CPPU的回收率R按以下公式计算:

式(2)及(3)中,N和A分别为整体柱固相萃取-HPLC分析时CPPU的萃取量(ng)和色谱峰面积,a₂及b₂为整体柱固相萃取-HPLC分析方法线性方程的斜率及截距,C_S及V_S为实际样品中CPPU的加标浓度( μ g/L)及体积(mL)。

2 结果与讨论

2.1 固相萃取整体柱的性能

2.1.1 固相萃取整体柱的形态表征

参照文献^{[ 15 ]}方法制备得到的MAA-co-EGDMA整体柱通过SEM表征其形貌特征,如图1所示。其中图1a为放大60倍时整体柱的截面图,图1b为放大 2000 倍时整体柱的内部形貌图。从图1可见固相萃取整体柱具有比较疏松的结构,结构较均匀,既有小颗粒与“簇”之间形成的中孔,也有小颗粒之间形成的微孔,保证了整体柱有良好的通透性。

图 1 不锈钢管固相萃取整体柱的扫描电镜图 Fig. 1 SEM images of stainless steel solid-phase extraction monolithic column

此外,聚合物颗粒的红外光谱结果显示,在 3437 cm^-1出现了单体甲基丙烯酸中的-OH特征伸缩振动峰,在2951 cm^-1处出现了-C-H的伸缩振动峰，在1730 cm^-1处出现了羰基的伸缩振动峰(这是甲基丙烯酸中的羧基以及二甲基丙烯酸乙二醇酯中酯的羰基峰)，在 1630 cm^-1处出现双键的伸缩振动峰。这些红外谱图中的特征峰与制备过程中添加试剂的红外谱图相吻合。

2.1.2 固相萃取整体柱的通透性

以水为流动相,采用流速实验测试制备的整体柱的通透性,得到其流速-压力曲线。结果表明,整体柱的压力(Y)与流动相流速(X)之间具有良好的线性关系,其线性方程为Y=0.3421X+0.3629,相
关系数R²=0.9975。在流动相流速超过2.5 mL/min 时,整体柱的柱压不超过1.3 MPa。当柱压为0.7 MPa时,该整体柱的流速可以达到1.0 mL/min,说明该不锈钢管整体柱具有很好的通透性。

2.2 整体柱固相萃取-HPLC在线分析装置

采用2个六通阀和整体柱构建了整体柱固相萃取-HPLC在线联用系统,其中六通阀Valve 1主要实现样品引入功能,Valve 2主要实现在线萃取、解吸和分析进样功能,通过两阀切换实现在线萃取解吸和分析检测(见图2)。在实际样品分析中,先将样品引入Valve 1的定量环中,然后通过泵1推动萃取溶剂将样品引入Valve 2中的整体柱进行萃取和净化;然后通过泵2将流动相引
入整体柱进行解吸进样,完成样品溶液在线萃取、解吸和分析过程。

图 2 整体柱固相萃取-HPLC在线联用装置示意图 Fig. 2 Schematic representation of on-line device based on monolithic column solid-phase extraction coupled with HPLC

2.3 固相萃取整体柱的萃取条件的优化

固-液两相之间的萃取和解吸是待测目标物在固-液相间分配、传质、平衡循环的一系列过程,因此萃取和解吸条件对在线萃取过程影响很大。本文分别考察了萃取溶剂的pH值及其流速、解吸溶剂的体积及其流速等主要因素对CPPU萃取量的影响。

2.3.1 萃取溶剂的pH值及其流速

根据氯吡脲的极性及文献^{[ 4 ]}的结果，本文以9 mL甲醇-水(1 ∶ 99,v/v)作为整体柱的萃取溶剂，考察了溶剂的pH值及其流速等因素对氯吡脲萃取效率的影响。考察以不同pH的甲醇-水(1 ∶ 99,v/v)为萃取溶剂时CPPU在固相萃取整体柱上的萃取量,结果如图3a所示。随着萃取溶剂pH的增加,CPPU的萃取量没有发生明显的变化,表明溶液pH值对CPPU萃取量的影响较小。考虑到萃取溶剂的经济成本以及环保等因素,最后选用了pH 6.0～7.0(即不调节pH,直接用)的甲醇-水(1 ∶ 99,v/v)作为萃取溶剂。

图 3 整体柱固相萃取条件的优化 Fig. 3 Optimization of extraction conditions a. pH of extraction solution; b. flow rate of extraction solvent; c. volume of desorption solvent; d. flow rate of desorption solvent.

萃取溶剂的流速与系统承受的压力有关,并直接影响CPPU的萃取效率。考察了不同萃取溶剂流速(0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL/min)对CPPU萃取量的影响,结果见图3b所示。在萃取溶剂流速为0.5 mL/min 时CPPU的萃取量最大；流速为0.7 mL/min 时CPPU的萃取量较流速为0.5 mL/min时减少了4.6% ;相比流速为0.5 mL/min,流速为0.8 mL/min 时萃取量只减少8.0% 。这可能是由于不锈钢管整体柱的通透性较好,样品溶液以渗透的形式接触到整体柱的吸附位点,从而使溶剂流速对CPPU的吸附量影响较小。为了加快分析速度,减少整体柱长时间承受较大压力,选取0.8 mL/min 为萃取溶剂流速。

2.3.2 解吸溶剂的体积及其流速

解吸溶剂的体积及其流速对整体柱的萃取性能及其与HPLC在线分析的溶剂和时间匹配性关系密切。解吸溶剂的体积过大、流速太高或太低都容易导致HPLC的谱峰展宽。本文考察了以流动相(乙腈-0.2%乙酸水溶液(50 ∶ 50,v/v))作为解吸溶剂,其体积和流速对CPPU解吸效果的影响,结果见图3c、3d。随着解吸溶剂的体积从0.4 mL增加到 1.2 mL,CPPU的萃取量略有增加,但0.4 mL的解吸溶剂基本可使整体柱内吸附的CPPU解吸完全。而随着解吸流速由0.2 mL/min 增大到0.3 mL/min,CPPU的萃取量明显增大;再继续增大流速观察,发现解吸溶剂的流速影响较小。为了缩短分析时间和减小HPLC中的峰展宽现象,选择0.4 mL/min 作为最优的解吸溶剂流速。

综上所述,CPPU萃取和解吸的优化条件为:萃取溶剂为9.0 mL甲醇-水(1 ∶ 99,v/v)溶液;萃取流速为0.8 mL/min;解吸溶剂为乙腈-0.2%乙酸水溶液(50 ∶ 50,v/v);体积为0.4 mL,流速为0.4 mL/min。

2.3.3 固相萃取整体柱吸附容量的考察

吸附容量是评价整体柱性能的重要指标。在最优的整体柱萃取和解吸条件下,用200 μ g/L 的氯吡脲标准溶液,通过改变标准溶液体积考察固相萃取整体柱的吸附容量,结果见图4。实验结果表明,当萃取体积达21 mL后,整体柱的吸附容量基本保持不变,此时整体柱的吸附容量为 1163 ng。

图 4 200μg/L 氯吡脲在整体柱上的吸附容量实验曲线 Fig. 4 Adsorption capacity of 200 μ g/L CPPU at flow rate of 0.8 mL/min

2.4 整体柱固相萃取-HPLC在线联用方法

2.4.1 分析方法的建立

配制不同浓度的CPPU标准溶液,在优化的萃取、净化和分析条件下,采用整体柱固相萃取-HPLC在线联用方法对其分析定量。在0.01～50.00 μ g/L 之间,以CPPU的峰面积(Y)对其质量浓度(X,μ g/L)进行线性回归,得到的线性方程为Y=5.24×10⁴X+61,相关系数r=0.9999,表明线性关系良好。以信噪比为3确定方法的检出限为25 ng/L。采用1.0 μ g/L 标准样品考察方法的精密度(n=5),其RSD为3.9% ,满足痕量分析要求。

实验中CPPU的富集因子为采用整体柱萃取富集后经HPLC分析得到的CPPU浓度和20 μ L直接进样的CPPU浓度的比值,结果表明在优化条件下,CPPU的富集倍数可达214倍。

2.4.2 实际样品分析

采用建立的方法测定了市售黑葡萄、猕猴桃和西瓜等3种水果样品,未检出CPPU(见图5)。分别对这些水果样品进行加标回收率测定,结果见表1。可见CPPU的回收率为87.0% ～120.7% ,RSD为0.6% ～9.2% ,表明基体对测定结果基本不产生干扰,方法的准确度较高,适合水果等复杂基体中痕量CPPU残留分析检测。

图 5 整体柱固相萃取-HPLC在线联用分析实际样品的色谱图 Fig. 5 Chromatograms of real fruit samples by monolith column SPE-HPLC in online mode a. original sample; b. spiked sample with 0.6 μ g/L CPPU.

表 1 水果样品中氯吡脲的加标回收率(n=3) Table 1 Recoveries of CPPU spiked in different fruits (n=3)

2.4.3 方法对比

表2给出了文献报道的采用固相萃取-HPLC测定水果中CPPU的结果对比。结果表明,与现有方法相比,本文新建方法的灵敏度较高,更适合复杂体系中痕量氯吡脲残留的分析检测。

表 2 本文方法与文献报道的固相萃取-HPLC方法测定水果中氯吡脲的对比 Table 2 Comparison of the proposed method with other methods from the references for the determination of CPPU in fruits

3 结论

本实验采用原位聚合法研制了高通透性MAA-co-EGDMA不锈钢管整体柱,整体柱的吸附容量达 1163 ng,富集倍数为214倍。建立了整体柱固相萃取在线富集-HPLC联用方法并在线分析了黑葡萄、猕猴桃和西瓜等水果中CPPU的残留量。方法的线性范围为0.01～50.00 μ g/L,检出限为25 ng/L,RSD 3.9% 。黑葡萄、猕猴桃和西瓜中氯吡脲的加标回收率为87.0% ～120.7% ,RSD为0.6% ～9.2% ,满足水果样品中痕量氯吡脲分析的要求。

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