色谱  2014, Vol. 32 Issue (4): 438-442   PDF (891KB)    
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张一丁
常翠兰
郭启雷
曹红
白玉
刘虎威
食品中柠檬黄铝色淀和日落黄铝色淀的毛细管区带电泳分析
张一丁1, 常翠兰1, 郭启雷2, 曹红2, 白玉1 , 刘虎威1    
1. 北京大学化学与分子工程学院分析化学研究所, 北京 100871;
2. 北京市海淀区产品质量监督检验所, 北京 100094
收稿日期：2013-11-6
基金项目：北京市科技计划项目（Z111100056811006）.
通讯作者：Tel:(010)62758198,Fax:(010)62751708,E-mail:yu.bai@ pku.edu.cn.
摘要：发展了一种新的采用毛细管区带电泳分析柠檬黄铝色淀和日落黄铝色淀的方法。通过前处理步骤成功实现了铝色淀中铝基质与色素的分离。利用石英毛细管柱（48.50 cm（有效长度40.00 cm）×50 μm），分别针对柠檬黄铝色淀和日落黄铝色淀进行了电泳条件的优化，并得到最优分离结果。所建立的定量分析方法的检出限对于柠檬黄铝色淀和日落黄铝色淀分别达0.26 mg/L和0.27 mg/L，线性范围分别为0.53~1.3×102mg/L和0.54~1.4×102mg/L，两种被分析物的测定重复性（RSD，n=6）分别为4.3%和5.7%，日间重复性（RSD，n=6）分别为5.6%和6.0%。经过更深入研究后，该方法可以发展为食品中相应色淀的检测方法。
关键词： 毛细管区带电泳     柠檬黄     日落黄     色淀     食品    
Analysis of tartrazine aluminum lake and sunset yellow aluminum lake in foods by capillary zone electrophoresis
ZHANG Yiding1, CHANG Cuilan1, GUO Qilei2, CAO Hong2, BAI Yu1 , LIU Huwei1    
1. Institute of Analytical Chemistry, College of Chemistry and Molecular Engineering, Peking University, Beijing 100871, China;
2. Haidian District Institute of Products Quality Supervision and Inspection, Beijing 100094, China
Received: 2013-11-6
Corresponding author：Tel:(010)62758198,Fax:(010)62751708,E-mail:yu.bai@ pku.edu.cn.
Abstract: A novel analytical method for tartrazine aluminum lake and sunset yellow aluminum lake using capillary zone electrophoresis (CZE) was studied. The pigments contained in the color lakes were successfully separated from the aluminum matrix in the pre-treatment process, which included the following steps: dissolve the color lakes in 0.1 mol/L H2SO4, adjust the pH of the solution to 5.0, then mix it with the solution of EDTA·52Na and heat it in a water bath, then use polyamide powder as the stationary phase of solid phase extraction to separate the pigments from the solution, and finally elute the pigments with 0.1 mol/L NaOH. The CZE conditions systematically optimized for tartrazine aluminum lake were: 48.50 cm of a fused silica capillary with 40.00 cm effective length and 50 μm i. d., the temperature controlled at 20.0 ℃, 29.0 kV applied, HPO42--PO43- (0.015 mol/L, pH 11.45) solution as running buffer, detection at 263 nm. The conditions for sunset yellow aluminum lake were: the same capillary and temperature, 25.0 kV applied, HPO42--PO43- (0.025 mol/L, pH 11.45) solution as running buffer, detection at 240 nm. The limits of detection were 0.26 mg/L and 0.27 mg/L, and the linear ranges were 0.53-1.3×102 mg/L and 0.54-1.4×102 mg/L for tartrazine aluminum lake and sunset yellow aluminum lake, respectively. The RSDs were 4.3% and 5.7% (run to run, n=6), 5.6% and 6.0% (day to day, n=6) for tartrazine aluminum lake and sunset yellow aluminum lake, respectively. Further developments for this method could make it a routinely used method analyzing color lakes in foods.
Key words: capillary zone electrophoresis (CZE)     tartrazine     sunset yellow     color lakes     foods    

食品安全是人们日常生活中需要面对的重要问题,食品添加剂或非食用物质的违规、超量使用是许多食品安全问题的原因。因此,分析化学能够提供的对于食品添加剂或非食用物质的定性定量检测是保障食品安全的重要基础。

食用色素是为了改善食品色泽而在食品和部分药品加工过程中添加的物质[ 1 ]。通常的色素为水溶性物质。为了适应非水体系或疏水体系(如糖衣、肉肠、糕点等)对着色的要求,水溶性色素被制成色淀使用,即将可溶性色素吸附、沉降在不溶性基质上形成的色淀染料。可用的基质有氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化钡等,相应地称为铝色淀、钙色淀、钡色淀等,其中铝色淀应用最为广泛。合成色素多以芳香烃等经过磺化、硝化、偶氮化等一系列有机反应而成,往往含有偶氮、芳环、氧杂蒽结构等[ 2 ],因此多具有一定毒性。有研究指出,长期食用含有色素或色淀的食物存在引起过敏、哮喘、DNA损伤、致畸、致癌等后果的风险[ 3 ],故色素、色淀的使用范围和用量受到严格限制。我国许多标准对此有严格要求[ 4 ]。例如对于柠檬黄及其铝色淀的限量为0.04 g/kg(蛋卷)～0.5 g/kg(果酱等),对日落黄及其铝色淀的限量为0.02 g/kg(谷类甜品等)～0.6 g/kg(固体饮料)(限量均指色素的质量)。

一般认为,色淀中的色素与基质通过配位作用或离子键等结合,色淀没有确定的化学组成和化学结构式,并且色淀化过程不破坏色素本身的分子结构。在色淀质量和限量标准中针对其色素含量有严格的要求[ 5,6,7,8 ],且法规中对于色淀的使用限量规定均是指换算后的色素质量,因此色淀的分析方法必须能够测定所添加的色淀中色素的含量,而非色淀总含量。

针对水溶性色素的分析方法较为容易,高效液相色谱(HPLC)和毛细管电泳(CE)方法均有报道,且已形成国家标准[ 9,10,11,12 ]。但是针对色淀的分析方法却鲜有报道,更无国家标准方法。究其原因,铝色淀的分析必须使其中的色素与铝基质分离。在针对铝色淀进行分析的为数不多的文献中,有3种分离色素和铝基质的方法。(1)采用酸性溶液溶解色淀,然后调整pH使铝离子沉淀并离心除去,得到色素溶液[ 13 ]; (2)用碱性溶液直接提取色淀中的色素[ 3 ]; (3)将色淀溶解后用聚酰胺粉吸附色素[ 10 ],再洗脱进行分析。分析主要采用HPLC方法,但有不足之处。例如沉淀除去铝离子的不完全性、沉淀过程中色素的损失、碱性溶液提取过程导致铝基质的部分溶解带来的干扰等,并且HPLC也具有其自身的不足,比如分析成本高、色谱柱寿命有限等。本文从铝色淀的性质出发,探索将其处理成适合CE进样的样品前处理方法,然后采用毛细管区带电泳(CZE)进行分析。我们希望能够利用CE高效率、高速度、低消耗等特点弥补HPLC方法的不足,成为色淀分析的新方法。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

Agilent 7100高效毛细管电泳仪,配备二极管阵列检测器(DAD)(Agilent Technologies,美国);熔融石英毛细管(内径50 μ m,总长度48.50 cm,有效长度40.00 cm,邯郸市鑫诺光纤色谱有限公司)。柠檬黄铝色淀、日落黄铝色淀(食品用,色素含量30.4%(质量分数),上海嘉汇精细化工有限公司);聚酰胺粉(聚己内酰胺,100～200目,常州长丰化工有限公司);样品滤膜(0.22 μ m,混合纤维素(MCM)和聚四氟乙烯(PTFE)材质，天津博纳艾杰尔科技有限公司);三羟甲基氨基甲烷(Tris，国药集团化学试剂有限公司);十水合四硼酸钠(北京益利精细化学品有限公司);氢氧化钠(分析纯，西陇化工股份有限公司);硫酸(优级纯，北京化工厂);乙腈(色谱纯，天津四友生物医学技术有限公司);乙酸、磷酸钠、十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、乙二胺四乙酸二钠(EDTA\52Na)、乙酸铵、乙酸钠、乙醇、甲醇、丙酮均为分析纯(北京化工厂);实验用水为娃哈哈饮用纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。实际样品为绿箭无糖薄荷糖(茉莉花茶味)(箭牌糖果(中国)有限公司)。

1.2 样品前处理

称取柠檬黄铝色淀、日落黄铝色淀固体,分别置于容量瓶中用0.10 mol/L H2SO4溶解,使色淀的质量浓度分别为0.493 g/L 和0.503 g/L;以色淀中色素含量为30.4%(质量分数)计,柠檬黄和日落黄色素的质量浓度分别为0.150 g/L 和0.153 g/L。将此浓度的色淀溶液以0.10 mol/L H2SO4稀释,使基浓度为原浓度的8.00×10-1、6.00×10-1、4.00×10-1、2.00×10-1、1.00×10-1、8.00×10-2、6.00×10-2、4.00×10-2、2.00×10-2、1.00×10-2、8.00×10-3、6.00×10-3、4.00×10-3、2.00×10-3倍,并在每个浓度的溶液中添加无水乙酸钠固体使乙酸钠的浓度为0.100 mol/L。用1.0 mol/L NaOH溶液将上述各浓度溶液的pH调至4.98～5.02。取调整pH后的各浓度色淀溶液,分别与等体积的0.160 mol/L 乙二胺四乙酸二钠溶液混合后,于60 ℃水浴中加热60 min。

在1 mL注射器管中填入聚酰胺粉,每支注射器中填入0.120 g,压紧粉末使之填至0.3 mL刻度处,制成固相萃取小柱。依次用H2O、0.1 mol/L H2SO4、H2O通过小柱,然后移取1.00 mL前述水浴处理后的色淀溶液通过小柱。再依次用H2O、0.1 mol/L H2SO4、H2O通过小柱进行冲洗。减压尽量除去冲洗所用溶液,然后用0.1 mol/L NaOH溶液对色素进行洗脱。将NaOH溶液缓慢通过小柱,弃去前150 μ L流出液,收集第150至450 μ L流出液(共300 μ L),以0.22 μ m PTFE滤膜过滤后作为样品进行CZE分析。对各个浓度的色淀溶液均如此处理;聚酰胺粉小柱、PTFE滤膜均为一次性使用。

对实际样品进行前处理时需依据样品性质开发不同的处理方法。对可溶性样品(如糖果等)可按上述方法直接溶解处理;对不溶性样品(如糕点等)则需增加研磨、除去蛋白质等步骤,此处不予详述。

1.3 CZE条件

柠檬黄铝色淀的分析条件:运行温度为20.0 ℃;压力进样5 kPa(50 mbar)×10.0 s;缓冲液为混合磷酸盐溶液(磷酸钠和磷酸氢二钠),总磷酸盐浓度为0.015 mol/L,pH 11.45;分离电压为29.0 kV;检测波长为263 nm。

日落黄铝色淀的分析条件:运行温度为20.0 ℃;压力进样5 kPa(50 mbar)×10.0 s;缓冲液为混合磷酸盐溶液(磷酸钠和磷酸氢二钠),总磷酸盐浓度为0.025 mol/L,pH 11.45;分离电压为25.0 kV;检测波长为240 nm。

2 结果与讨论
2.1 定量分析方法学

针对柠檬黄铝色淀和日落黄铝色淀的CZE分析方法学评价数据见表1。

表 1 柠檬黄铝色淀和日落黄铝色淀的CZE方法学评价数据* Table 1 Method validation of the proposed CZE method for tartrazine aluminum lake and sunset yellow aluminum lake*

在优化的实验条件下,柠檬黄铝色淀和日落黄铝色淀的CZE谱图见图1。

图 1 (a)柠檬黄铝色淀和(b)日落黄铝色淀的CZE谱图 Fig. 1 Electropherograms of (a) tartrazine aluminum lake and (b) sunset yellow aluminum lake by CZE CZE conditions: a. running buffer: HPO2-4-PO3-4 (0.015 mol/L,pH 11.45); capillary: fused silica capillary with 50 μ m i. d.,48.50 cm total length,40.00 effective length; voltage: 29.0 kV; injection: 5 kPa (50 mbar)×10.0 s; detection at 263 nm. b. running buffer: HPO2-4-PO3-4 (0.025 mol/L,pH 11.45); voltage: 25.0 kV; detection at 240 nm; others,the same as Fig. 1a.
2.2 前处理条件的选择和优化

1.2节的样品前处理条件是优化后的结果,主要包括铝色淀的酸溶解、用EDTA\52Na处理、过聚酰胺粉小柱3个步骤。我们还尝试过其他前处理方法,如(1)直接将铝色淀溶解进样;(2)将铝色淀溶解后过聚酰胺粉小柱;(3)将铝色淀溶解后用EDTA\52Na处理等。实验结果证明这些前处理方法的电泳结果均不好。铝色淀溶解后直接测试所得典型电泳结果见图2。分析其原因认为,虽然色淀样品能够被强酸或强碱性体系溶解,但其铝基质溶解后的存在形式很可能为胶体形式(氢氧化铝胶体)。此外,即使溶解后的样品为溶液,在毛细管内进行电泳时由于运行缓冲液的pH不如溶解样品时溶剂的pH那么极端,样品在毛细管内可能进一步胶体化。此推断后被证实:用激光照射色淀溶液时明显可见光路。由于胶体粒子并无固定的分子质量和电荷,从而在CZE分离时在较长的时间里都有携带了色素分子的胶体粒子通过毛细管的检测窗口,使得峰宽且响应低。过聚酰胺粉小柱亦无法完全分离胶体粒子和色素分子,故无法获得较好的电泳结果。

图 2 柠檬黄铝色淀溶解后直接测定的电泳图 Fig. 2 Electropherogram of tartrazine aluminum lake injected directly after dissolving Sample dissolved in 0.05 mol/L HPO2-4-0.05 mol/L PO3-4 solution to a concentration of 2.5 g/L; running buffer: 0.01 mol/L HPO2-4-0.01 mol/L PO3-4; capillary: fused silica capillary with 50 μ m i. d.,48.50 cm total length,40.00 effective length; voltage: 25.0 kV; injection: 5 kPa(50 mbar)×10.0 s; detection at 200 nm.

配位试剂被应用到前处理过程中以更好地分离色素与铝基质。改进后,铝色淀样品先被强酸溶液溶解,然后调整pH至5以适合EDTA与铝离子的配位反应,再与过量的EDTA\52Na溶液混合加热 以使配位反应完成。此时的溶液为色素与铝配合物 的混合液,经过聚酰胺粉小柱后色素被吸附于柱上(在酸性环境下),冲洗后再以碱性溶液洗脱,即可获得较纯的色素溶液,可用于CZE分析。经过对配位反应方式、温度、时间、EDTA用量、聚酰胺粉用量、吸附、洗涤方式等的条件优化后,最终确定了本文1.2节的前处理条件。

2.3 CZE条件的选择和优化

采用CZE方法时需优化的条件一般为缓冲液种类、pH、缓冲液浓度、有机添加剂、运行温度、分离电压、进样量等。本实验中,首先尝试了系列不同种类和pH的缓冲液,包括乙酸-乙酸钠体系(pH 5.01)、硼砂(pH 9.17)、磷酸盐体系(pH 6.85、7.54、8.28、9.24、10.72、11.45、12.49)、三羟甲基氨基甲烷-盐酸体系(pH 8.42)等,根据样品的分离情况,以及色谱峰峰高和峰形情况,最终确定采用pH 11.45的磷酸盐缓冲体系。

采用正交试验优化了缓冲液浓度、运行温度、分离电压和有机添加剂(乙腈)的使用。由于多数物质在200 nm处均有响应，为了更好地体现体系中杂质和其他参数不稳定造成的影响，正交实验中在该波长下进行测定。表2和表3为L9(34)正交试验结果。

表 2 柠檬黄铝色淀CZE条件的正交试验结果 Table 2 Results of orthogonal experiments for the CZE conditions of tartrazine aluminum lake

表 3 针对日落黄铝色淀的正交试验结果 Table 3 Results of orthogonal experiments for sunset yellow aluminum lake

表2和表3中最右一列(峰高)为检测波长为200 nm时的样品峰高度。此处选择峰高而非峰面积是因为峰高可以更好地反映峰形的优劣。表的最下端3行(T1～T3)为对应因素在3个测试水平下的峰高之和,用于反映该因素在何水平下效果最好。根据实验结果显示的趋势，并且考虑到实验经验和仪器参数的可控范围,最终确定了1.3节的柠檬黄铝色淀和日落黄铝色淀测定的电泳条件。

2.4 实际样品的测定

采用建立的方法分析了实际样品绿箭无糖薄荷糖(配料中含柠檬黄铝色淀)。将其研磨成粉末状后取3份,1份用于样品中含有的柠檬黄铝色淀的检测,测得柠檬黄铝色淀含量为0.002 g/L;另2份分别添加一定量的柠檬黄铝色淀和日落黄铝色淀标准品后进行加标回收率的测定,结果如表4所示。图3为一个实际样品的电泳谱图。

表 4 实际样品中柠檬黄铝色淀和日落黄铝色淀的检测和加标回收率结果 Table 4 Results of real samples and spiked recoveries of tartrazine aluminum lake and sunset yellow aluminum lake

图 3 实际样品(含柠檬黄铝色淀)的电泳谱图 Fig. 3Electropherogram of a real sample containing tartrazine aluminum lake CZE conditions: running buffer: HPO2-4-PO3-4(0.015 mol/L,pH 11.45); capillary: fused silica capillary with 50 μ m i. d.,48.50 cm total length,40.00 effective length; voltage: 29.0 kV; injection: 5 kPa (50 mbar)×10.0 s; detection at 263 nm.
1. tartrazine aluminum lake.
3 结论

本文发展了一种新的CZE分析柠檬黄铝色淀和日落黄铝色淀的方法。前处理方法采用EDTA处理酸溶解后的铝色淀使其中的铝基质形成配合物,使用聚酰胺粉净化。本方法较好地使色素与铝基质得到分离,使其后续可采用多种仪器分析手段。 实验结果可见将CZE用于色淀的分析达到了与 HPLC相当的灵敏度,并且具有足够的线性范围。尽管如此,本方法的前处理步骤仍然较为复杂,且需要针对不同性质的实际样品开发不同的前处理方法。但本方法仍为色淀的CE分析提供了可能性,且有良好的应用前景。

参考文献
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[6]GB 4481. 2-2010
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[9]GB/T 9695. 6-2008
[10] SN/T 1743-2006
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