Acquity UPLC超高效液相色谱系统,Quattro Premier XE三重四极杆质谱仪(Waters公司); Visiprep^TM SPE真空固相萃取装置(Supelco公司); Oasis MAX固相萃取小柱(200 mg/6 mL,Waters公司); BEH HILIC色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μ m,Waters公司)。1.0 mL一次性无菌注射器(浙江玉升医疗器械有限公司);有机相针式滤器(13 mm×0.2 μ m,上海安谱科学仪器有限公司)。

苦氨酸、苦味酸(99.5% ,AccuStandard公司);甲醇、乙腈、甲酸(HPLC级,TEDIA公司);醋酸、氨水(优级纯,国药集团);实验用水为去离子水。

地表水样品12个,采自浙江省宁波市亭下水库、晈口水库、横山水库和白溪水库。废水样品7个,采自浙江省杭州市萧山区某采矿场周围水域。

水样使用100 mL棕色玻璃瓶采集,于4 ℃冷藏运输、保存,6 h内检测。地表水样品使用一次性无菌注射器吸入约1.0 mL,经过0.2 μ m有机相针式滤器过滤后注入液相色谱进样小瓶中待测。废水样品采用固相萃取净化,具体流程如下:用3 mL甲醇和3 mL水活化固相萃取小柱;将10 mL废水样品通过小柱,用5 mL 5%氨水淋洗小柱,弃去流出液;用10 mL含2%(v/v)甲酸的甲醇溶液将目标物从小柱中洗脱出来,收集洗脱液,取1 mL待测。

柱温40 ℃;流速0.25 mL/min;进样量5.0 μ L;分离时间3 min。流动相:乙腈-水(90 ∶ 10,v/v)。苦味酸、苦氨酸的保留时间分别为0.86和1.13 min。苦味酸和苦氨酸混合标准溶液的色谱图见图1。

图1

Fig. 1

图1 苦味酸和苦氨酸混合标准溶液的HILIC色谱图 Fig.1 HILIC chromatogram of picric acid and picramic acid

三重四极杆串联质谱多反应监测(MRM);电喷雾电离(ESI)正离子电离模式;毛细管电压3.0 kV;离子源温度100 ℃;脱溶剂气温度200 ℃;脱溶剂气流量450 L/h;锥孔气流量50 L/h,各目标化合物的质谱分析参数见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 苦味酸、苦氨酸的LC-MS参数 Table 1 LC-MS parameters of picric acid and picramic acid Compound Cone voltage/V Collision energy/eV Dwell time/s Quantitative ion pair Qualitative ion pair Picric acid 38 19 0.2 228＞182 228＞198 Picramic acid 45 19 0.2 198＞182 198＞138

表1 苦味酸、苦氨酸的LC-MS参数 Table 1 LC-MS parameters of picric acid and picramic acid

亲水色谱柱是近年来发展起来的针对强极性化合物的新型液相色谱柱。本文对比了反相C18色谱柱(Acquity UPLC BEH C18 column,100 mm×2.1 mm,1.7 μ m)和亲水作用色谱柱(Acquity UPLC BEH HILIC column,100 mm×2.1 mm,1.7 μ m)对苦味酸的保留,结果见图2。

图2

Fig. 2

图2 不同色谱柱分析苦味酸的UPLC-MS/MS色谱图 Fig.2 UPLC-MS/MS chromatograms of picric acid with different columns

从图2可以看出,在HILIC色谱柱中,采用乙腈/水体系分析苦味酸,不仅实现了强极性化合物的保留,而且灵敏度极高,峰形良好,无须使用缓冲盐;在同样的等度流动相情况下,苦味酸标准物质在C18色谱柱中出现一个很宽的延展峰,无法实现有效保留。

质谱条件的优化是通过在流动注射模式下对1.0 mg/L 的两种物质单独进样完成的。首先比较了ESI和大气压化学电离(APCI)两种电离源。在SIM模式下,ESI中两种化合物的灵敏度明显高于APCI,这与ESI更适用于极性物质的结论相符^{[ 11 ]}。在MRM模式中,苦味酸和苦氨酸最主要的子离子都是m/z 181.7,对于苦味酸是[M-H-NO₂]^-,对于苦氨酸是[M-OH]^-,二级质谱图见图3。

图3

Fig. 3

图3 苦味酸和苦氨酸的二级质谱图-MS/MS色谱图 Fig.3 MS/MS spectra of picric acid and picramic acid

在对废水样品进行处理时,选取了适合强酸性物质的Oasis MAX固相萃取小柱进行萃取。由于本方法的检测灵敏度足够高,本研究未进行复杂的样品浓缩富集,简化了样品前处理流程,既缩短了检测时间,又提高了检测准确度。在低、中、高3种浓度水平下同时添加两种化合物标准品(加标质量浓度为1.0、10.0、100.0 μ g/L),在地表水样品中的回收率为89% ～107% ,在废水样品中的回收率为72% ～101% ,相对标准偏差不超过20% 。

实验室空白和方法空白均未检出目标化合物。以2.0、20.0、100.0 μ g/L 空白加标溶液做6次平行试验,相对标准偏差为 4.9% ～14.7% 。以空白实际水样为基质,添加标准溶液,通过低浓度曲线外推法确定检出限(三倍信噪比),苦味酸和苦氨酸的检出限分别为0.1和0.3 μ g/L,满足国家地表水标准限值要求^{[ 12 ]}。

在15个地表水样品中均未检出苦味酸和苦氨酸,在6个采矿场周围水域样品中苦味酸检测结果为未检出～59.5 μ g/L;苦氨酸检测结果为未检出～12.3 μ g/L。