铁棒锤是毛茛科乌头属植物铁棒锤(Aconitum pendulum Busch)的块根,气特异,味辛而麻舌,有毒,为陕、甘、宁等省应用较广的一种民间草药。该药具有祛瘀活络、止血镇痛等作用,可用于神经痛、风湿关节痛、妇女痛经、胃痛、牙痛及跌打损伤等治疗。现代药理研究发现,该药具有抗炎、麻醉止痛、抗肿瘤等作用[ 1,2 ]。文献[ 3,4,5,6 ]报道其化学成分主要是aconitine型C19二萜生物碱,该成分具有药用作用的同时还有较强的毒性;此外,还有甾体及糖苷等成分。咪唑类生物碱作为生物碱的一个重要组成部分,在抗菌、抗病毒、抗凝血、镇痛、抗炎症、抗肿瘤和抗心血管疾病等方面表现出很好的生物活性[ 7,8 ]。但目前尚未见铁棒锤中咪唑类生物碱的相关报道。
有关铁棒锤化学成分分离的研究报道大多采用传统柱色谱方法[ 9,10 ],该方法存在样品组分损失、污染、变性、失活、拖尾、分离困难及回收率低等不足。高速逆流色谱(high-speed counter-current chromatography,HSCCC)是一种不使用固态支撑体或载体的液液分配色谱技术,它克服了固相载体对样品的吸附损失、变性等缺点,因而在植物有效成分的分离与制备方面得到了广泛的应用[ 11,12,13 ]。本课题组利用HSCCC技术从存放3年的铁棒锤根中分离得到了一种咪唑类生物碱成分1H-imidazole-2-carboxylic acid,butyl ester (ICABE)(化学结构式见图1),为铁棒锤化学成分的进一步开发利用奠定了基础。
Agilent 1260高效液相色谱仪,配备Chemstation for LC 3D system (B.04.03)工作站、G1311C四元泵(内置脱气机)、G1316柱温箱、G1315D二极管阵列检测器、G1316A柱温箱、G1329B自动进样器、色谱柱为Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μ m)(美国安捷伦公司); N-1001型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司); TBE-300B半制备型高速逆流色谱仪(上海同田生化技术有限公司),配有TBP-5002泵、UV500紫外检测系统、聚四氟乙烯管(PTFE)分离柱(内径2.6 mm,分离柱体积290 mL)及N2010色谱工作站和溶剂选择系统(浙江大学智达信息工程有限公司); DC-0506恒温循环器(上海舜宇恒平科学仪器有限公司); AM400核磁共振仪(瑞士Bruker公司)。
铁棒锤根于2009年8月采集于青海省互助县北山乡,由中国科学院西北高原生物研究所孙菁副研究员鉴定。萃取及HSCCC分离用的试剂氯仿、甲醇、乙酸乙酯、无水乙醇和正己烷均为分析纯,氨水(白银银环化学制剂厂),浓盐酸(含量37% ),HPLC分析用甲醇为色谱纯(山东禹王公司),实验用水为超纯水。
取干燥的铁棒锤根4 kg,粉碎,按23 mL/g液料比投料,于58 ℃下用95%的酸性乙醇(精确量取0.83 mL浓盐酸,以95%的乙醇定容到1 L,得pH 2的酸性乙醇)回流提取2次,每次2 h,合并提取液后减压浓缩至无醇味;加入使浸膏能充分溶解的最少量的水,置于分液漏斗中,用2倍体积的氯仿萃取除去杂质,然后用氨水调pH至10左右,再用氯仿萃取3次,回收氯仿,得到提取物22.2 g,作为HSCCC待分离样品,放置冰箱内备用。
取1～2 mg待分样品加入静置分层的两相溶剂系统中,剧烈振荡1 min,待样品充分溶解、分层后,取上、下两相各2 mL,用高效液相色谱(HPLC)检测,上相峰面积为A1,下相峰面积为A2,分配系数K=A1/A2。
在分液漏斗中按正己烷-氯仿-乙醇-水(10 : 1 : 13 : 2,v/v/v/v)配制两相溶剂系统共 2080 mL,充分振摇后静置过夜。以上相为固定相,下相为流动相,使用前分别超声脱气30 min。将100 mg待分离样品粉末完全溶解于10 mL上相溶液中,备用。
以最大流速将溶剂系统上相泵入主机并充满分离螺线管,开启循环水浴并将温度设定为25 ℃。开启主机电源以850 r/min 正向旋转,待转速稳定后,泵入流动相,待流动相从管柱出口流出且基线稳定后,将样品溶液由进样圈注入。管柱出口处流出液在230 nm波长下连续检测,根据色谱图手动收集各色谱峰组分,用HPLC检测纯度。
色谱柱:Eclipse XDB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μ m)。流动相:乙腈和水;梯度洗脱程序:0～30 min,59%乙腈;30～32 min,59%乙腈～70%乙腈;32～40 min,70%乙腈～90%乙腈;40～50 min,90%乙腈。流速1.0 mL/min;柱温:30 ℃;检测波长:230 nm;进样量：10 μ L。
HSCCC分离得到的化合物ICABE结构由1H-NMR、13C-NMR数据进行鉴定。
在HSCCC中,溶剂体系的选择至关重要。主要考虑溶剂对分离物质的溶解性、分配系数K、分离因子 α 、分层时间及分离过程中固定相保留率等的影响。HSCCC最合适的K值范围是0.5～2,当K＜＜0.5时,目标化合物与杂质峰重叠无法分离;当K＞＞2时,会使分离时间延长、峰展宽严重,目标化合物的纯度降低[ 14,15,16 ];分离因子 α 应大于1.5;另外,溶剂系统的乳化会将固定相带出,进而影响保留率,因此其分层时间应小于30 s[ 17 ]。
本实验根据文献和经验,选用了3种不同的溶剂系统,采用HPLC方法测定目标化合物在两相中的分配系数K。从铁棒锤氯仿提取物的HPLC谱图可以看出,目标化合物邻近有3个峰干扰程度较大(见图2),因此我们分别分析比较了3种不同溶剂系统对目标化合物及邻近3个干扰峰的分配系数,结果见表1。
由表1可知,在所选溶剂系统中,采用氯仿-甲醇-0.08 mol/L盐酸和正己烷-氯仿-乙醇-水(10 : 1 : 11 : 2,v/v/v/v)时,干扰峰的分配系数与目标成分的分配系数接近,不利于目标成分的分离;正己烷-氯仿-乙醇-水(10 : 1 : 13 : 2,10 : 1 : 14 : 2,v/v/v/v)及正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(10 : 1 : 11 : 2,10 : 1 : 13 : 2,v/v/v/v)可以给出满足条件的K值。采用上述4个溶液系统时干扰峰与目标成分的分离因子 α (以最小的 α 计)分别为2.1、1.44、1.81、1.54。考虑到样品成分复杂,为尽量减小干扰峰的影响,故选择正己烷-氯仿-乙醇-水(10 : 1 : 13 : 2,v/v/v/v)作为HSCCC分离的溶剂系统。
实验同时对流动相流速、主机转速和分离温度进行了优化,结果发现,在流速为1.8 mL/min、转速为850 r/min、温度为25 ℃条件下,固定相保留率达到75% ,分离结果令人满意。在此分离条件下,从100 mg待分离样品中一次性分离得到7.5 mg ICABE。HSCCC分离谱图见图3。经峰面积归一化法测定ICABE的纯度大于98%(见图4)。
HSCCC制备获得的化合物为淡黄色油状物,其1H-NMR (400 MHz,CDCl3)数据:7.71 (m,1H,H-4),7.52(m,1H,H-5),4.31(t,J=6.0 Hz,2H,H-1′),1.72(m,2H,H-2′),1.45(m,2H,H-3′),0.96(t,J=6.0 Hz,3H,H-4′);其13C-NMR(100 MHz,CDCl3)数据: 167.6(C=O),132.2(C-2),130.8(C-4),128.7(C-5),65.4(C-1′),30.5(C-2′),19.1(C-3′),13.6(C-4′)。核磁共振碳谱中167.6数据表明分子中存在-COO-基团;氢谱中7.71 (m,1H)和7.52(m,1H)数据结合碳谱中132.2、130.8和128.7数据表明分子存在一个咪唑环,且酯基中的羰基碳和咪唑环C2(132.2)相连,氢谱中4.31(t,J=6.0 Hz,2H)、1.72(m,2H)、1.45(m,2H)、0.96(t,J=6.0 Hz,3H)数据结合碳谱中65.4、30.5、19.1和13.6数据表明分子中存在-OCH2CH2CH2CH3基团。通过以上数据确定该化合物为1H-imidazole-2-carboxylic acid,butyl ester(ICABE)。
本研究利用高速逆流色谱技术,以正己烷-氯仿-乙醇-水(10 : 1 : 13 : 2,v/v/v/v)为两相溶剂系 统,从铁棒锤醇提物的氯仿提取物中分离到了 一种咪唑类生物碱ICABE,经峰面积归一化法测定纯度达到98%以上。本研究不仅弥补了铁棒锤咪唑类生物碱分离研究的空白,而且提供了一种高效的分离制备方法,与传统分离方法相比,该方法具有简便、快速、节省溶剂的特点,具有较好的实际应用价值。
2014, Vol. 32 Issue (5): 543-546
PDF (846KB)
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