API 4000电喷雾-串联四极杆质谱仪,配Analyst 4.1.5软件(美国应用生物系统公司); Agilent 1200型液相色谱仪(美国安捷伦公司); B-260型恒温水浴锅(上海雅荣生化仪器设备有限公司); Milli-Q纯水机(美国Millipore公司); Mach1.6 R冷冻型离心机(美国Thermo公司)。头孢洛宁标准物质:产品编号32904,CAS号5575-21-3,由美国Sigma公司提供;正己烷为国产分析纯;甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯(美国Fisher公司)。

头孢洛宁标准储备液(500 mg/L):准确称取头孢洛宁标准物质5.00 mg,置于10 mL容量瓶中,用30%(v/v)乙腈水溶液溶解并定容至刻度,配成500 mg/L 标准溶液,于4 ℃冰箱中避光保存。临用前用甲醇-0.1%甲酸水溶液(3 ∶ 7,v/v)稀释成头孢洛宁系列标准工作液,现用现配。0.1%甲酸水溶液:取1 mL甲酸,置于 1000 mL容量瓶内,用超纯水定容至刻度,超声后使用。甲醇-0.1%甲酸水溶液(3 ∶ 7,v/v):取30 mL 甲醇与70 mL 0.1%甲酸水混匀即得。

准确称取(1.00±0.01) g牛奶置于15 mL离心管中。加入5 mL乙腈,涡旋1 min,置于振荡器上以300 r/min 振荡10 min,在4 ℃条件下,以 9000 r/min 离心10 min。转移上清液至10 mL试管中,在37 ℃水浴中氮气吹干,加入1 mL甲醇-0.1%甲酸水溶液(3 ∶ 7,v/v)复溶,涡旋1 min,溶液转移至2 mL离心管中,加入0.8 mL正己烷除脂,涡旋1 min,在4 ℃下 15000 r/min 离心10 min,弃去正己烷,过0.22 μ m有机相针式过滤器至2 mL棕色进样瓶中,LC-MS/MS分析。

头孢洛宁标准溶液(1 mg/L)分别在正离子和负离子模式下全扫描,发现头孢洛宁在正离子模式下的响应值更高。头孢洛宁标准溶液(1 mg/L)在正离子模式下全扫描,得到[M+H]⁺(m/z 459.4)准分子离子峰。对m/z 459.4进行二级质谱全扫描,得到头孢洛宁二级全扫描质谱图(见图1)。结合头孢菌素质子化离子的一般断裂规律^{[ 13 ]}可知,头孢洛宁的质谱行为较简单，主要为R2断裂(见图2)得到的m/z 123.4和337.3; C(6)-C(7)键及C(7)-C(8)键断裂导致 β -内酰胺环开环得到的m/z 152.3和309.3;而m/z 337.3进一步裂解又可得到m/z 152.3。其中m/z 337.3和152.3的强度相对较大,干扰较小,故选择m/z 337.3作为定量离子,

图1

Fig. 1

图1 头孢洛宁的二级质谱图 Fig.1 MS/MS spectrum of cefalonium

图2

Fig. 2

图2 头孢洛宁的结构式 Fig.2 Chemical structure of cefalonium m/z 152.3为辅助定性离子。

头孢洛宁属于 β -内酰胺酶类抗生素,结构式中既有游离羧基,又带有氨基,为两性物质,极性小^{[ 14 ]}。所选色谱柱的填料应为直链烷烃键合的硅胶,其中最常见的为十八烷基键合硅胶(即C₁₈)。研究对比了Phenomenex Luna C₁₈ (150 mm×2.1 mm,3.5 μ m)和Waters C₁₈(150 mm×2.1 mm,5 μ m)色谱柱。两种色谱柱对头孢洛宁均有良好的保留,头孢洛宁均可得到优异的峰形。综合考虑,本文选择Phenomenex Luna C₁₈ (150 mm×2.1 mm,3.5 μ m)色谱柱。为了改善峰形及提高分离度,增强目标物在反相色谱柱上的保留,经常在流动相溶液中添加甲酸、乙酸等酸性物质或者甲酸铵、乙酸铵等缓冲盐。在水相中添加0.1%的甲酸^{[ 15 ]}及对流动相条件的调整能使头孢洛宁在色谱柱上较好的保留(保留时间在6.1 min左右),响应值高,峰形优良。

准确称取1 g空白牛奶7份分别置于15 mL离心管中,按1.3节方法处理样品,用所得空白基质液分别配制头孢洛宁标准工作液(2、5、10、20、50、100、200 μ g/L),用HPLC-MS/MS进行检测。每一水平设5个平行样品同日检测,连续测定5日。以头孢洛宁峰面积平均值为纵坐标(Y),质量浓度为横坐标(X，μ g/L)绘制标准曲线,求得牛奶中头孢洛宁的回归方程Y=2944.9X+2227.5,相关系数r=0.9996。

准确称取空白牛奶1 g,依次加入不同质量浓度(1、5、10、20、50 μ g/L)的头孢洛宁标准工作液100 μ L,涡旋混匀,使得样品中头孢洛宁的添加浓度分别为0.1、0.5、1、2、5 μ g/kg,按1.3节方法处理样品。以S/N≥3确定检出限(LOD),以S/N≥10确定定量限(LOQ)。牛奶中头孢洛宁的检出限为0.5 μ g/kg,定量限为2 μ g/kg。

回收率和精密度采用在空白牛奶中添加标准溶液的方法进行检测。其MRM谱图见图3和图4。根据残留限量要求及欧盟对头孢洛宁设置的MRL,在LOQ、1/2MRL、MRL、2MRL 4个添加水平,1 g空白牛奶中分别添加20、50、100、200 μ g/L 的头孢洛宁标准工作液100 μ L,即牛奶中添加浓度为2、5、10、20 μ g/kg,旋涡混匀,按1.3节方法处理样品,每一水平设5个平行样品同日检测,连续测定5日。求得空白牛奶中添加头孢洛宁回收率的平均值(X)和标准差(SD),同时计算日内和日间相对标准偏差。结果表明,头孢洛宁在牛奶中的平均回收率介于78.5% ～86.2%之间,日内相对标准偏差为1.5% ～6.2% ,日间相对准偏差为2.9% ～5.6%(见表1)。

图3

Fig. 3

图3 空白牛奶的MRM谱图 Fig.3 MRM chromatogram of a blank milk sample

图4

Fig. 4

图4 空白牛奶添加2 μ g/kg 头孢洛宁的MRM谱图 Fig.4 MRM chromatogram of a blank milk sample spiked with cefalonium at 2 μ g/kg m/z 152.3为辅助定性离子。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 牛奶中头孢洛宁的加标回收率及相对标准偏差(n=5) Table 1 Recoveries and relative standard deviations (RSDs)of cefalonium spiked in milk (n=5) Spiked/( μ g/kg) Recovery/% Intra-day RSD/% Inter-day RSD/% 2 78.5±2.3 1.8 2.9 5 84.5±3.7 2.3 4.4 10 86.2±3.1 1.5 3.6 20 80.8±4.5 6.2 5.6

表1 牛奶中头孢洛宁的加标回收率及相对标准偏差(n=5) Table 1 Recoveries and relative standard deviations (RSDs)of cefalonium spiked in milk (n=5)

取20份空白牛奶,添加MRL水平的头孢洛宁标准溶液,按1.3节方法处理样品,用HPLC-MS/MS进行检测,记录其峰面积;于室温条件下放置24 h后重新检测,比较两次峰面积的变化。结果显示,牛奶样品中头孢洛宁的峰面积变化在-3.35% ～ 3.80%之间,说明样品在室温条件下放置24 h内, 头孢洛宁稳定性良好。

样品基质溶液对待测物的电喷雾离子化影响较大,可抑制或增强信号响应,导致检测结果的准确度与精密度降低。本试验通过在空白牛奶基质提取液中添加低、中、高3个浓度即2、20、200 μ g/L 的头孢洛宁标准溶液,与纯溶剂中的信号强度进行比较,牛奶基质峰面积与纯溶剂的峰面积比值分别为64% ～92% 、75% ～88% 、80% ～86% ,说明牛奶基质对头孢洛宁检测有抑制效应。为消除样品基质效应的影响,采用空白基质匹配标准溶液法进行校准。

从不同市场购买新鲜牛奶10份,从超市购买国产蒙牛、伊利品牌盒装牛奶各10份,以及新西兰、澳大利亚进口盒装牛奶各10份,每份100 mL,共50份样品,按本方法进行样品前处理和检测。结果显示,所有国产样品均未检测出头孢洛宁残留,有1份新西兰进口样品检测出8.0 μ g/kg 头孢洛宁残留。这是因为头孢洛宁在国内尚未批准使用,有关头孢洛宁防治奶牛乳房炎的制剂还处于研发阶段,尚未投入生产。上述结果表明该方法可用于检测牛奶中头孢洛宁的残留量。