高效液相色谱-质谱联用仪:1290 二元泵液相系统和G6530A Q-TOF高分辨质谱系统(安捷伦公司,USA)。Sigma 3-30ks离心机(希格玛公司,德国); N-EVAP11氮吹仪(Organomation公司,USA)。Milli-Q去离子水发生器(Millipore公司,USA)。甲酸、甲醇、乙腈(HPLC级,Honeywell Burdick & Jackson)。赤霉素、6-苄基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸标准品(德国Dr. Ehrenstorfer公司)。C₁₈、N-丙基乙二胺(PSA)吸附剂(博纳艾杰尔公司);硅胶、硅藻土、中性氧化铝(国药集团化学试剂公司);无水硫酸钠、乙酸、盐酸、无水乙醇等均为国产分析纯试剂。

分别准确称取GA3、6-BA、4-CPA标准品10.0 mg置于10 mL棕色容量瓶中,用甲醇溶解并定容,配制成1.0 g/L 的标准储备液,转入棕色样品瓶中,同时配制1.0 mg/L 的标准溶液,-20 ℃下保存。实验时用空白豆芽样品提取液配制标准工作溶液,现用现配。

准确称取2 g(精确至0.01 g)打碎混匀后的豆芽样品于聚四氟乙烯离心管中。加入2 g无水硫酸钠、0.5 g氯化钠,充分搅拌去除水分;加入20 mL含1%(v/v,下同)乙酸、50%乙醇、49%乙腈的溶液,振荡混匀5 min;以 9000 r/min 离心5 min,收集上清液于50 mL聚四氟乙烯离心管中。残渣中加入10 mL盐酸溶液(1 mol/L)和10 mL乙腈,振荡提取5 min,以 9000 r/min 离心,收集上层乙腈溶液。合并两次提取液,在提取液中加入1.0 g硅藻土、10 mL正己烷,振荡混匀5 min,以 9000 r/min 离心5 min后弃去正己烷层。剩余溶液在50 ℃水浴条件下氮吹至近干,加入2.0 mL 50%甲醇水溶液,振荡混匀,过0.22 μ m滤膜后上机测定。

色谱仪:Agilent 1290 Infinity LC。色谱柱:ZORBAX Eclipse Plus C₁₈(100 mm×3.0 mm,1.8 μ m)；柱温:30 ℃。进样体积:10 μ L。流动相:0.1%甲酸水溶液(A)和甲醇(B)。梯度洗脱程序:0～1.0 min,80%A; 1.0～8.5 min,80%A降到50%A; 8.5～8.6 min,50%A降到1%A;8.6～13.0 min,保持1%A; 13.0～13.1 min,1%A升到80%A;13.1～15.0 min,保持80%A。流速:0.4 mL/min。

质谱仪:Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF;离子源:双喷射离子源(Dual AJS ESI);雾化气压强：275.8 kPa;干燥气温度325 ℃,流速8 L/min;鞘气温度350 ℃,流速11 L/min。负离子模式:毛细管电压 3000 V;毛细管出口电压(fragmentor)130 V;锥孔电压(skimmer)65 V;八极杆电压750 V。采集模式:targeted MS/MS。一级质谱扫描范围m/z 100～500,采集频率5 spectra/s;二级质谱扫描范围m/z 50～500,采集频率10 spectra/s,窗口时间0.4 min,碰撞池能量30 V;四极杆分辨率Medium m/z 4。参比离子m/z 112.9855、301.9981。质谱调谐:负离子模式自动调谐;质量范围:低于 m/z 1700;扩展动态范围2 GHz。

targeted MS/MS模式下,同时对3种目标化合物进行一级、二级质谱全扫描,通过化学工作站软件建立3种目标化合物一级、二级质谱全扫描筛查库。定性分析时,根据目标化合物的一级、二级质谱精确质量数、保留时间、同位素丰度匹配、特征二级离子等检索确认。定量分析时,以准分子离子[M-H]^-峰面积外标法计算,提取质量数宽度为15 ppm。

为得到更好的色谱分离和质谱离子化效率,本文参考有关标准和文献方法^{[ 2, 4, 5, 14, 15, 16 ]},以甲醇-水作为流动相体系。水相中分别添加0.1%甲酸和5 mmol/L 甲酸铵,用这两种流动相体系和Agilent Poroshell 120 EC-C₁₈ (100 mm×3.0 mm,2.7 μ m)、Agilent ZORBAX Eclipse Plus C₁₈(100 mm×3.0 mm,1.8 μ m)、Agilent Eclipse XDB-C₁₈(150 mm×2.1 mm,3.5 μ m) 3种色谱柱进行交叉实验。结果显示,流动相为甲醇-水(0.1%甲酸)、色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C₁₈柱时,液相色谱流速设置可满足质谱检测要求,质谱离子化效率较高,3种目标物的色谱分离对称、峰形尖锐。图1为在以上优化条件下3种目标化合物的准分子离子[M-H]^-提取色谱图。

3种目标物具有不同的化学性质:6-BA难溶于水,可溶于酸、碱,在酸性、碱性条件下均稳定;4-氯苯氧乙酸在样品中多以4-氯苯氧乙酸钠形式存在,4-氯苯氧乙酸钠易溶于水、碱性水溶液,酸化后生成4-氯苯氧乙酸,易溶于乙醚、乙醇等有机溶剂;GA3难溶于水,能溶于醇、酮、酯类等有机溶剂。

据此,本方法采用QuEChERS前处理技术,对比3种不同方式的回收效果：酸化乙腈(含1%乙酸)一次性提取、酸化乙醇-乙腈(1%乙酸+50%乙醇+49%乙腈)一次性提取、酸化乙醇-乙腈(1%乙酸+50%乙醇+49%乙腈)提取后再在酸化条件下以乙腈盐析二次提取。结果酸化乙醇-乙腈溶液效果较好,但对4-CPA的回收效率不高,主要原因是仍有4-CPA以钠盐形式存在于试样残渣中,没有被有机溶剂提出。在以酸化乙醇-乙腈提取后的残渣中加入稀盐酸溶液和乙腈,利用盐析分层在酸性条件下以乙腈溶剂提取4-CPA,结果4-CPA回收效率得到有效改善。在以酸化乙醇-乙腈溶液提取目标物时,必须加入无水硫酸钠、氯化钠除去试样中的水分,因为水的存在会严重影响各目标物的回收效率,且无水硫酸钠、氯化钠也是下一步乙腈盐析分层提取的必要试剂。另外测试了乙醇-乙腈提取液中乙醇体积分数变化对回收效果的影响。当乙醇含量增加时会增多基质干扰物的提取,但其含量过低则不利于GA3的提取,乙醇体积分数在50%时能满足回收效果和基质净化需求。在50 μ g/kg 添加水平下,各目标物在3种不同提取条件时的添加回收率如图4所示,分两步提取时各化合物的添加回收效果最优。

图4

Fig. 4

图4 不同提取液对豆芽中目标物的提取效果 Fig.4 Effect of different extraction solutions on the target compounds in been sprouts Extraction solutions: 1. 1% acetic acid+99% acetonitrile; 2. 1% acetic acid+50% ethanol+49% acetonitrile; 3. step one: 1% acetic acid+50% ethanol+49% acetonitrile and step two: diluent hydrochloric acid+acetonitrile.

考察了C₁₈、PSA、硅藻土、硅胶、氧化铝5种分散剂的净化效果。C₁₈、PSA、硅胶、氧化铝等4种分散剂分别不同程度地存在吸附目标物或基质干扰物去除效果不好等问题;而硅藻土没有吸附目标化合物现象,对样品色素等基质干扰物的净化效果也优于其他试剂。硅藻土用量为0.2～1.5 g时,均未发生目标化合物吸附现象。从实际净化效果看,硅藻土吸附剂可净化样品提取液中的部分色素类物质,当其用量高于1.0 g后,增加分散剂用量对基质净化效果无明显改善。因此确定硅藻土用量为1.0 g。

基质物质在色谱分离过程中与目标化合物共流出,可能影响目标化合物的离子化过程,进而影响定量、线性、精密度等^{[ 21 ]}。豆芽样品经过前处理过程后,提取液在提取目标化合物的同时也会提出豆芽内源基质物质和前处理过程中引入的外源基质物质。本方法考察了豆芽基质对3种目标化合物的质谱影响,用空白豆芽提取液配制10 μ g/kg 的目标化合物标准液,用甲醇-水(5 ∶ 5,v/v)溶液配制同等浓度的标准溶液,计算两者质谱响应强度的比值。结果显示6-BA、Ga3、4-CPA的比值分别为0.97、1.08、0.68。虽然固相分散剂的使用在一定程度上降低了基质抑制,但仍不能彻底解决。为此,本方法采用基质提取液配制标准工作溶液进行校正补偿^{[ 22 ]},以进一步降低基质抑制对检测结果的干扰。

应用本方法对从市场抽取的15批次黄豆芽、绿豆芽样品进行检测,检出1批次绿豆芽中6-BA含量为0.24 mg/kg,1批次黄豆芽中GA3含量为0.19 mg/kg,1批次黄豆芽中4-CPA含量为0.49 mg/kg。分别应用DB33/T 625.3-2007 和SN/T 0350-2012 方法对检出6-BA、GA3的两份样品进行测定,测得6-BA、GA3含量分别为0.28 mg/kg、0.16 mg/kg,与本方法结果一致。用不含3种目标化合物的黄豆、绿豆培育10批豆芽样品,应用本方法对其进行检测分析,均未检测出3种目标化合物。结果证明本方法的有效性。