P230高压恒流泵、EC2000色谱数据工作站(大连依利特分析仪器有限公司)。

葡萄糖(分析纯,纯度99.9% )、潘糖(分析纯,纯度99.9% )、麦芽糖(分析纯,纯度99.5% )、冰乙酸(分析纯,纯度99.5% )、浓硫酸(分析纯)(天津科密欧);阿卡波糖(拜耳医药保健有限公司);糖化酶样品1、2、3(湖南长沙某公司);去离子水(自制,Milli-Q超纯水纯化系统过滤)。

色谱柱为SUGAR SH1011色谱柱(300 mm×8.0 mm,6 μ m;日本Shodex公司),流动相为0.01 mol/L 硫酸溶液,流速为0.6 mL/min,进样量为20 μ L,柱温为60 ℃,检测器为RI-201H示差折光检测器(日本Shodex公司)。

样品处理方法:移取0.4 mL 0.75 g/L 阿卡波糖缓冲液(用20 mol/L 醋酸缓冲液(pH 4.8)溶解)和0.1 mL糖化酶稀释液(将糖化酶原液用去离子水稀释20倍)置于10 mL具塞试管中,涡旋混匀;将试管放于37 ℃水浴中平衡10 min,吸取0.5 mL 20%(质量分数)麦芽糖溶液(用20 mol/L 醋酸缓冲液(pH 4.8)溶解)置于试管中,涡旋混匀,然后将试管放入37 ℃水浴中,培养20 h后取出,在开水中煮沸10 min灭酶,冷却至室温;加入9 mL流动相,充分混匀,过0.45 μ m滤膜。

空白处理方法:移取0.4 mL前述0.75 g/L 阿卡波糖缓冲液和0.1 mL糖化酶稀释液置于10 mL具塞试管中,涡旋混匀;将试管放于37 ℃水浴中平衡10 min,涡旋混匀,然后将试管放入37 ℃水浴中,培养20 h后取出,在开水中煮沸10 min灭酶,冷却至室温;吸取0.5 mL 20%(质量分数)麦芽糖溶液于试管中,混合均匀;加入9 mL流动相,充分混匀,过0.45 μ m滤膜。

潘糖标准储备液处理方法:称取1.0 g (精确到0.001 g)潘糖于100 mL容量瓶中,加入流动相稀释到刻度,配成质量浓度为10 g/L 的标准储备液。

由于产生的三糖较多,本方法中以潘糖为代表。通过液相色谱分析,得到样品溶液和空白溶液中潘糖的峰面积之差,采用外标法定量,求得潘糖的转化量,从而间接测得转苷酶的活性。

高效液相色谱法测定糖类化合物含量具有快速、灵敏等优点,故常用来测定糖类化合物。氨基柱常被用来测定糖类化合物,但采用氨基柱时流动相中含有乙腈,分析成本高,环境污染大,而且以乙腈/水体系为流动相容易出现示差检测器基线波动大、平衡慢的问题,所以本实验选择SUGAR SH1011色谱柱,以硫酸水溶液为流动相测定潘糖含量。实验结果表明当硫酸浓度为0.01 mol/L 时,葡萄糖、麦芽糖、潘糖和杂质分离效果较好(见图1)。

图1

Fig. 1

图1 (a)糖化酶样品及(b)空白溶液的HPLC谱图 Fig.1 Chromatograms of (a) a diastatic enzyme sample and (b) a blank solution 1. panose; 2. maltose; 3. glucose.

阿卡波糖在pH 4.8时抑制糖化酶的效果最佳,转苷酶的转苷最佳pH为5.5^{[ 11 ]}。综合考虑选择pH 4.8的醋酸缓冲液作为样品及空白溶液的培养介质。

转苷酶在一定条件下将麦芽糖转化为潘糖等三糖。从图2中可以看出,随着培养时间的增长,酶解产生的潘糖逐渐增多,但是在20 h之内的增长速度较快;在20 h之后,随着麦芽糖浓度的下降和产生三糖浓度的增高,增长速度变缓慢。考虑到时间关系,本文选择培养时间为20 h。

图2

Fig. 2

图2 培养时间对潘糖转化量的影响 Fig.2 Effect of the incubation time on the transformation of panose

由化学动力学原理可知,只要底物浓度足够大,即可保证麦芽糖分解产生的三糖浓度只与酶浓度有关,而与麦芽糖浓度无关。但麦芽糖底物中常含有游离的三糖,随着麦芽糖浓度的增大,游离三糖的量也随之增大,导致空白值较高而影响测定结果。通过实验发现麦芽糖的质量分数为20%时较为合适(见图3),此时底物浓度已足够高,但空白溶液中游离三糖的浓度不是很高,不至于影响测定结果。

图3

Fig. 3

图3 底物(麦芽糖)的浓度对潘糖转化量的影响 Fig.3 Effect of the concentration of substrate (maltose) on the transformation of panose

实验中阿卡波糖的作用是抑制糖化酶将麦芽糖转化为葡萄糖。实验结果表明,随着阿卡波糖用量的增大,产生葡萄糖的量逐渐下降。本实验使用阿卡波糖的质量浓度为0.75 g/L,当阿卡波糖的用量为0.4 mL时,产生葡萄糖的量基本趋于平衡(见图4),所以选择阿卡波糖的用量为0.4 mL。

图4

Fig. 4

图4 抑制剂(0.75 g/L 阿卡波糖)用量对葡萄糖转化量的影响 Fig.4 Effect of usage of the inhibitor (0.75 g/L acarbose) on the transformation of glucose

用流动相逐级稀释10 g/L 潘糖标准储备液得到一系列浓度的标准溶液,分别进行分析。实验表明,在0.1～10 g/L 范围内,其质量浓度X(g/L)与峰面积Y呈良好的线性关系,相关系数r为 0.9998,线性方程为Y=489.53X+7.61。分别按3倍信噪比(S/N=3)、10倍信噪比(S/N=10)确定转苷酶活性检出限为0.013 U、定量限为0.043 U。

应用建立的方法对2号糖化酶样品重复6次测定。6次平行测定的RSD为0.63% ,表明方法的重复性较好。

将糖化酶样品用去离子水稀释20倍,按照1.3节的方法处理,在1.2节的色谱条件下进行测定,得到糖化酶样品1、2、3中转苷酶的活性分别为3.91、3.91、1.03 U。