子宫颈癌细胞(HeLa)来源于中国医学科学院血液病研究所; RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640培养基和青霉素/链霉素购自美国Gibco Invitrogen公司;新生牛血清购自德国Biochrom AG公司;氢氧化钠、盐酸、丙酮、胰蛋白酶、碳酸氢铵(NH₄HCO₃)、二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)、碘代乙酰胺(iodoacetamide,IAA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、蛋白酶抑制剂(protease inhibitor cocktail)和甲氧脲(O-methylisourea)购自美国Sigma公司;苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonylfluoride,PMSF)购自美国Ameresco公司;聚乙二醇单辛基苯基醚(Triton-X 100)购自美国Bio Basic公司;C₁₈ AQ反相色谱填料(5 μ m,12 nm)购自日本DAISO Chemical公司,75 μ m和150 μ m内径毛细管购自美国Polymicro公司;乙腈为色谱纯,购自美国Merck公司。其余试剂均为国产分析纯。实验用水为Milli-Q超纯水。

Surveyor HPLC液相色谱系统(配有脱气机和四元液相泵)及LTQ Velos双压线性离子阱质谱系统(配有纳升电喷雾离子源和六通阀)购自美国Thermo公司。

HeLa细胞用RPMI 1640培养基(含10%(v/v)新生牛血清,青霉素和链霉素的终浓度分别为1 unit/mL和1 μ g/mL)在37 ℃和5% CO₂条件下培养。待细胞生长至对数生长期后用胰蛋白酶消化,于 1 000 g离心力下离心3 min,收集细胞。用4 ℃预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次后加入细胞裂解液(8 mol/L 尿素、1%(v/v) Triton-X 100、65 mmol/L DTT、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L PMSF、2%(v/v) cocktail、40 mmol/L pH 7.4的Tris-HCl)^{[ 10 ]},用超声波细胞碎裂仪碎裂细胞。于4 ℃ 25 000 g离心力下离心60 min,弃去上清液,用4 ℃丙酮洗涤2次,在通风橱中干燥后存于-80 ℃备用。

将提取的蛋白质复溶于1 mL含8 mol/L 尿素和0.1 mol/L NH₄HCO₃的变性溶液中;再加入DTT,在56 ℃水浴环境中还原1 h;加入IAA,在避光条件下对打开的二硫键处理40 min;用0.1 mol/L NH₄HCO₃将溶液稀释到1 mol/L,加入适量胰蛋白酶,在37 ℃的水浴环境中过夜。

采用实验室自制的C₁₈固相萃取柱对得到的酶解产物除盐纯化,真空干燥后存于-20 ℃待用。

将O-甲氧脲试剂用3～4 mol/L 的NaOH溶液配制成浓度为0.8 mol/L 的溶液,调节pH值至11.0。取干燥的蛋白质酶解产物500 μ g,加入制备好的O-甲氧脲溶液 1 000 μ L,用0.1 mol/L pH 11.0的NaHCO₃调节pH值至10.0～11.0。在65 ℃的水浴环境下反应10 min后除盐,干燥待用。

将长15 cm、内径75 μ m的毛细管柱在高温下拉成内径约为3 μ m的尖头,用气压法将C₁₈ AQ填料压入柱中制成C₁₈毛细管柱,用于上样。用HPLC系统分离处理过的HeLa细胞蛋白质酶解产物溶液。样品以5 μ L/min 的流速进样2 min到富集柱上。以250 nL/min 的流速对富集的肽段进行洗脱。流动相A是0.1%(v/v)的甲酸水溶液,流动相B是0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液。洗脱梯度为:0～2 min,0%B～3%B; 2～92 min,3%B～35%B; 92～95 min,35%B～80%B; 80%B保持10 min; 105～110 min,80%B～100%A; 100%A保持10 min。

采用LTQ Velos质谱仪的正离子模式进行肽段检测,喷雾电压为1.8 kV。采用数据依赖模式进行采集,包含一次MS全扫描(m/z 425～2 000),分辨率为 60 000,对其中丰度前10的峰进行二级MS/MS扫描分析。

实验所得的MS2数据用Maxquant(version 1.4.1.2)软件转化成“*. mgf”文件,再通过Mascot (version 2.3.0)在人源蛋白质数据库(IPI human v.3.52. fasta,包含 55 303 个条目)进行检索。选择胰蛋白酶酶切,允许最多两个漏切位点,固定修饰设定为半胱氨酸碘代酰胺烷基化(57 Da),可变修饰为甲硫氨酸氧化(16 Da)及赖氨酸侧链和肽链N端胍基化(47 Da),母离子的质量容忍偏差为10 ppm,碎片离子为0.05 Da。导出肽段时通过设置score＞25、P＜0.01控制假阳性率(FDR)＜1% 。

如图1所示,经胍基化反应后,多肽侧链上的赖氨酸转化为高精氨酸。取按实验部分所述方法处理得到的胍基化肽段25 μ g,复溶于0.1%(v/v)甲酸水溶液中,利LC-MS/MS进行分析,通过检索数据库鉴定肽段。为了考察标记效率,需要将标记的和未标记的肽段分别鉴定出来,在检索时将赖氨酸侧链和肽链N端胍基化(47 Da)设定为可变修饰。得到的结果见表1,其中用于统计标记效率的赖氨酸包括位于C端的赖氨酸(如IGAEVYHNLK)和由于漏切产生的位于肽段中间的赖氨酸(如LKEIVTNFLAGFEA)。测得胍基化效率为96.8% ,比文献报道的平均标记效率(95% )高^{[ 11 ]},说明该反应比较完全。肽链N端被标记比例只占6.8% ,说明胍基化具有很好的选择性。由于标记效率较高、选择性好,在进行数据库检索时,我们将赖氨酸侧链胍基化(47 Da)设为固定修饰。

图 1 胍基化反应原理图 Fig. 1 Schematic diagram of the guanidination

表 1 HeLa细胞蛋白质酶解肽段胍基化反应的标记效率和选择性 Table 1 Labeling efficiency and selectivity of the guanidination of peptides in HeLa cell digest Peptide Number Guanidination efficiency/% All peptides 10200 — Peptides with lysine 6261 — Peptides with lysine guanidination 6061 96.8 Peptides with N-term guanidination 702 6.9

表 1 HeLa细胞蛋白质酶解肽段胍基化反应的标记效率和选择性 Table 1 Labeling efficiency and selectivity of the guanidination of peptides in HeLa cell digest

图 2 HeLa细胞蛋白质酶解肽段在胍基化前后质谱鉴定结果中 (a)肽段的互补性、(b)C端有赖氨酸的肽段的互补性、(c)中间含赖氨酸的肽段的互补性及(d)不含赖氨酸的肽段的互补性 Fig. 2 Overlap of (a) identified peptides,(b) peptides with lysine at C-term,(c) peptides with lysine in the middle and (d) peptides without lysine in HeLa cell digest before and after the guanidination

2.3 胍基化对肽段在二级质谱中碎裂的影响

为了进一步探究上述胍基化影响肽段质谱响应的原因,对对照组和实验组二级质谱图的离子碎裂情况进行了统计学分析。质谱检测时,质子化的肽段沿着肽链骨架发生断裂,因发生断裂的位置不同而产生6种类型的离子:N端产生a、b、c离子,C端产生相应的x、y、z离子^{[ 12 ]}。在本实验条件下,产生的主要为b、y离子。运用本实验室开发的程序,我们可以统计出每条肽段二级质谱图鉴定到的b、y离子的数目。如肽段VNQIGSVTESLQACK,平均鉴定到的b、y离子数目分别是13和15。按照b/(y+b)计算其b离子所占的比例为46.4% ,按照y/(y+b)计算y离子所占的比例为53.6% 。 对所有鉴定到的肽段的b、y离子比例进行概率统计,结果见图3。

图 3 (a)C端为赖氨酸的肽段和(b)不含赖氨酸的肽段胍基化 前后y离子的比例分布图 Fig. 3Ratio distributions of y ions of (a) peptides with lysine at C-term and (b) peptides without lysine before and after the guanidination

C端为赖氨酸的肽段在胍基化后,y离子比例大于40%的肽段在所有肽段中所占的比重都相应提高,如图3a所示,其总比重由原来的38.8%上升至50.0% 。而b离子占主体的肽段比原来均有所减少。说明胍基化产生了更多的y离子信息。这可能是由于赖氨酸的胍基化发生在肽段C端,其碱性更强且容易捕获离子化质子,在正离子检测模式下,这类肽段骨架断裂主要发生在C端,产生了更多的y离子。由于这部分新增的离子碎裂信息,提高了这类肽段的质谱鉴定灵敏度,和对照组相比,鉴定结果中出现了许多新的肽段信息。

我们进一步对不含有赖氨酸的肽段进行分析,其y离子比例大于40%的肽段在所有肽段中所占的比例在胍基化前后分别为29.5%和31.1% ,没有明显变化,如图3b所示,说明胍基化对这类肽段的质谱检测基本没有影响。这可能是由于胍基化只选择性地发生在赖氨酸的侧链,因此不含赖氨酸的肽段的离子碎裂过程不受影响。

本文探讨了胍基化对复杂生物样品蛋白质组分析的影响,发现胍基化反应可以选择性地在赖氨酸侧链上发生,使C端为赖氨酸的肽段在总肽段中所占的比例从51.7%上升到57.3% ,在一定程度上提高了质谱鉴定的灵敏度和互补性。对鉴定到肽段的b、y离子比例进行统计学分析,发现胍基化后产生了更多的y离子碎裂信息,这可能是由于胍基化后赖氨酸碱性提高造成的。