甲醇、乙腈(色谱纯,德国Merck公司)。甲酸、碳酸氢铵(色谱纯,美国Fisher Scientific公司)。标样肉碱C2 ∶ 0-d3、肉碱C10 ∶ 0-d3、肉碱C16 ∶ 0-d3、溶血磷脂酰胆碱C12 ∶ 0、溶血磷脂酰胆碱C19 ∶ 0、鹅去氧胆酸-d4、胆酸-d4、苯丙氨酸-d5、色氨酸-d5、棕榈酸-d3、硬脂酸-d3、亮氨酸脑啡汰和兰索拉唑(美国Sigma-Aldrich公司)。超纯水由Milli-Q纯化系统(美国Millipore公司)制备。

参加实验的有15例超重/肥胖的多囊卵巢综合征患者(体重指数≥23)，于2011年6月到2012年12月纳入,均来自黑龙江中医药大学附属第一医院妇科门诊。所有受试者年龄都在15～35周岁,并且近3个月内没有服用激素类药物、无内分泌疾病。这项研究经黑龙江中医药大学附属第一医院机构伦理委员会批准(2010HZYLL-014),符合赫尔辛基宣言。所有受试者都签署了知情同意书。根据2003年5月欧洲生殖和胚胎医学会和美国生殖医学会在鹿特丹制定的诊断标准,符合以下3条标准中任意2条或全部即可确诊为PCOS:(1)卵巢排卵障碍,表现月经稀发或闭经;(2)临床或生化测定为高雄性激素水平(大于2 nmol/L);(3)至少一侧卵巢形态学呈多囊改变,单侧卵巢有或超过12个直径在2～8 nm的小卵泡,和(或)卵巢体积大于10 cm^{3[ 12 ]}。

PCOS患者口服小檗碱治疗药0.5 g/次,3次/日,连续治疗3个月。受试患者治疗前和治疗后的血样均于自然月经周期或孕激素撤退出血的3～5天早晨空腹采集。采集血样15 mL,静置30 min,于 3000 r/min 下离心10 min后,取血清,一部分用于测定多项临床指标,包括血促卵泡激素(follicle stimulating hormone, FSH)、黄体生成素(luteinizing hormone, LH)、雌二醇(estradiol, E2)、泌乳素(prolactin, PRL)、睾酮(testosterone, T)、硫酸脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone sulfate, DHEAS)、雌烯二酮(androstenedione, AND)、性激素结合球蛋白(sex hormone binding globulin, SHBG)、空腹葡萄糖(fast blood glucose, FBG)、总胆固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HLD)和低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)等;剩余的置于-80 ℃冰箱中保存,用于代谢组学分析。另外,治疗前和治疗后的患者通过葡萄糖耐量试验评价血糖和胰岛素,采集空腹血样及口服葡萄糖后30、60、120、180 min的血样。

将血样在4 ℃下解冻。从每例血清样品中取10 μ L于离心管中混匀,每份100 μ L分装成质量控制(QC)样本。QC样本用来测定进样前仪器状态及平衡色谱-质谱系统,也可以用来评价整个实验过程中系统的稳定性和实验操作的重复性^{[ 13 ]}。取100 μ L血清样本,加入400 μ L含有多个内标的提取液,用乙腈沉淀蛋白,提取液中加入的内标及相应的浓度见表1。振荡后,于 14000 g离心力、4 ℃条件下离心12 min;取上清液冷冻干燥,保存在-80 ℃冰箱中。进样前,样品用乙腈-水(1 ∶ 4, v/v)复溶(用于正离子模式分析的样品复溶体积为150 μ L,用于负离子模式分析的样品复溶体积为100 μ L),振荡后,于 14000 g离心力、4 ℃条件下离心10 min;取上清液进样分析。进样量分别为2 μ L(正离子模式分析)和3 μ L(负离子模式分析)。

超高效液相色谱分析仪器采用美国Agilent公司的Agilent 1290 Infinity。质谱仪为美国Agilent公司的Agilent 6540四极杆飞行时间质谱(quadrupole time-of-flight mass spectrometry, q-TOF MS)。采用电喷雾电离(ESI)正、负离子模式检测。正离子模式下,色谱柱为美国Waters公司的ACQUITY C8柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μ m),柱温为40 ℃。流动相A为0.1%甲酸水溶液,流动相B为0.1%甲酸乙腈。洗脱梯度:0～1 min为5%B; 1～24 min由5%B线性变化到100%B,保持4 min; 28～28.5 min由100%B线性降至5%B并保持3.5 min。负离子模式下,色谱柱为美国Waters公司的ACQUITY HSS T3柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μ m),柱温为50 ℃。流动相A为6.5 mmol/L 碳酸氢铵水溶液,流动相B为6.5 mmol/L 碳酸氢铵甲醇/水溶液(甲醇-水(95 ∶ 5, v/v))。洗脱梯度:0～1 min为2%B; 1～20 min由2%B线性变化到100%B,保持4 min; 24～24.5 min由100%B线性降至2%B并保持3.5 min。进样室温度为4 ℃。流动相流速为0.35 mL/min。

质谱系统在正、负离子模式下的参数:扫描范围为m/z 80～1000;脱溶剂气温度为350 ℃,流速为11 L/min;毛细管电压为 3000 V;碰撞电压为230 V。

原始数据用Agilent MassHunter工作站(Agilent, USA)进行色谱峰峰识别和峰匹配。导出的峰表按照80%原则去除零值^{[ 14 ]}。每个保留峰的强度用一个内标进行校正。SIMCA-P软件(version11.0, Sweden)进行多元统计分析。数据Pareto缩放后,经过正交信号校正进行偏最小二乘模式识别(orthogonal signal correction partial least-squares discriminant analysis, OSC-PLS-DA)。模型的预测能力用7倍交叉验证和响应置换试验的内部验证来评价。所有的临床数据及代谢组学结果都采用SPSS 17.0(SPSS inc., USA)进行分析非参数检验,p＜0.05表示有显著性差异。

PCOS患者治疗前后共30例血样经预处理后,采用UHPLC-q-TOF MS方法分别在正、负离子模式下进行分析检测,典型的PCOS患者血清的基峰离子流图如图1所示。峰匹配后,按照80%原则去除零值,再用内标校正代谢物离子的响应以降低系统误差。校正后,在正离子模式下获得 1404 个变量,在负离子模式下获得807个变量。依据精确质量数、保留时间、二级质谱信息、数据库信息及标准样品谱图等,我们对代谢物离子进行了结构鉴定,在正离子模式下共定性了73个代谢物,主要是肉碱、脂肪酰胺、溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine, LPC)及氨基酸等；在负离子模式下共定性了53个代谢物,主要是游离脂肪酸、氨基酸等。

图1

Fig. 1

图1 PCOS患者血清的典型基峰离子流图 Fig.1 Typical base peak chromatograms (BPC) from the serum sample of the PCOS patient a. ESI+mode; b. ESI- mode.

QC样本用来评价分析方法的重复性^{[ 13 ]}。图2a和图2b分别为正、负离子模式下QC样本中代谢物离子的RSD分布。正离子模式下,93.7%离子的RSD小于20% ,它们的色谱峰面积相应累积值占全部峰面积的96.0% ;负离子模式下,93.2%离子的RSD小于20% ,它们的色谱峰面积相应累积值占全部峰面积的88.7% 。结果显示,分析平台的重复性良好,所得到的代谢组学数据可以用于下一步的多元统计分析。

为了找出与小檗碱治疗相关的差异变量,将小檗碱治疗前后分别在正、负离子模式下得到的所有代谢离子信息与临床生化数据信息整合,进行了OSC-PLS-DA模式识别分析,结果见图3。从OSC-PLS-DA得分图(图3a)可以看出,小檗碱治疗前后的样本可以得到明显的区分。表示模型解释能力的参数R²Y=0.892,表示模型预测能力的参数Q²(cum)=0.577；且模型通过了随机置换试验,没有过拟合，表明小檗碱治疗影响PCOS患者的代谢轮廓。

图3

Fig. 3

图3 小檗碱治疗前后的OSC-PLS-DA分析结果 Fig.3 OSC-PLS-DA model results of PCOS patients before treatment and after treatment a. score plot; b. loading plot. INS: insulin release test; AUC: area under curve.

载荷图上离原点越远的点表明对模式识别模型的分类贡献越大。图3b红色方框标出的点与临床上胰岛素水平有关,对模型分类贡献较大。PCOS患者小檗碱治疗前后血中胰岛素变化见图4a。临床生化数据表明,与治疗前比,患者在治疗后的60 min胰岛素水平显著性升高(p=0.019), 180 min胰岛素水平有所回落。说明小檗碱在一定程度上能改善PCOS患者的胰岛素敏感性,提高对血糖的调节能力。

根据模型的变量重要因子(variable importance in the project, VIP),我们从OSC-PLS-DA模型中挑选出VIP＞1的代谢物离子,并经过非参数检验,p＜0.05认为有显著性差异。通过上述两步,筛选出了与小檗碱治疗相关的差异代谢物,包括2个磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine, PC)(PC(32 ∶ 0)和PC(34 ∶ 1))、1个鞘磷脂(sphingomyelin, SM)(SM(d18 ∶ 1/15 ∶ 0))、芥子酸酰胺(erucamide)和硬脂酸(stearic acid)。这几个差异代谢物均为脂类,与治疗前相比,治疗后血清中的含量都显著性升高(见图4b～4f)。

图4

Fig. 4

图4 (a)小檗碱治疗前后胰岛素释放试验曲线和(b～f)治疗前后差异代谢物的相对含量 Fig.4 (a) Insulin release test curves of PCOS patients before and after treatments and (b-f) relative concentrations of differential metabolites before and after treatments in PCOS patients PC: phosphatidylcholine; SM: sphingomyelin. p＜0.05, before treatment vs. after treatment.

芥子酸酰胺作为内源性的脂肪酰胺,与油酸酰胺、花生四烯酸乙醇胺等一样都可作为信号分子。芥子酸酰胺可以刺激血管生成,并可以调节体内水的含量平衡^{[ 15 ]}。磷脂酰胆碱作为细胞膜磷脂的主要成分,在细胞功能中发挥着重要作用,具有乳化、分解油脂的作用,可以增进血液循环,改善血清脂质。同时研究表明磷脂酰胆碱中的饱和及单不饱和酰基链可保护细胞免受氧化应激导致的细胞死亡^{[ 16 ]}。鞘磷脂也是构成细胞膜的重要组成部分。鞘磷脂可以通过鞘磷脂合成酶从神经酰胺合成得到,也可以通过鞘磷脂水解酶分解为神经酰胺。鞘磷脂与糖尿病的发生密切相关。Makinen等^{[ 17 ]}报道鞘磷脂可能与毛细血管损伤、胰岛素抵抗及饱和脂肪酸在分子水平上存在联系。另外,鞘磷脂也与脂肪肝及肥胖存在关系^{[ 18 ]}。硬脂酸是常见的脂肪酸,参与人体多种生理过程。Kurotani等^{[ 19 ]}认为较高的胰岛素抵抗水平会引起体内硬脂酸含量过高。Liu等^{[ 20 ]}通过脂肪酸代谢轮廓分析,发现棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸等可以作为区分单一性负荷后糖尿病与2型糖尿病的潜在标志物。以上差异代谢物表明,小檗碱可影响PCOS患者的脂质代谢通路,而这些脂质通路与胰岛素抵抗密切相关。结合临床生化信息,可显著改善胰岛素的敏感程度。

除此之外,在实验中,采用UHPLC-q-TOF MS方法共检测出21种肉碱。相对于治疗前,6种中长链肉碱(carnitine): carnitine 10 ∶ 0、carnitine 10 ∶ 1、carnitine 12 ∶ 0、carnitine 12 ∶ 1、carnitine 14 ∶ 1和carnitine 14 ∶ 2在大部分的受试患者体内都是升高的(见图5)。乙酰肉碱是长链脂肪酸在线粒体中 β -氧化的媒介,是参与脂肪代谢和供能的重要物质。我们以往的研究表明,中链肉碱对脂肪酸 β -氧化具有生理活性,提高中链肉碱浓度可促进脂肪酸 β -氧化^{[ 21 ]}。多数受试患者血清中肉碱水平的升高表明小檗碱可能提高 β -氧化能力,与胰岛素敏感程度改善密切相关。结合文献报道,小檗碱可调节PCOS患者的胰岛素抵抗、脂类代谢异常及能量代谢异常。

有文献^{[ 22 ]}报道小檗碱能明显降低高血脂患者体内甘油三酯的水平。小檗碱是通过激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase)的活性上调脂类分解基因的表达和下调脂类合成基因的表达来达到降低甘油三酯水平的目的^{[ 23 ]},而甘油三酯是临床上评价肥胖型的PCOS患者体内代谢紊乱程度的重要指标。我们把甘油三酯与一些重要的代谢物及临床生化数据综合起来并进行了相关性分析^{[ 24 ]},结果见图6。从图6中我们可以明显看出,甘油三酯的含量与亮氨酸、缬氨酸、LPC、溶血磷脂酰乙醇胺(lysophosphatidylethanolamine, LPE)及1-花生四烯酸甘油呈正相关。LPC能诱导炎症反应、细胞凋亡和癌症细胞的侵袭^{[ 25 ]},近期的研究也发现,LPC在葡萄糖代谢中有重要作用,可以作为胰岛素抵抗的潜在生物标志物^{[ 26 ]}。Zhao等^{[ 10 ]}研究表明,在PCOS中,亮氨酸和缬氨酸这些支链氨基酸与胰岛素抵抗和肥胖密切相关。1-花生四烯酸甘油则是甘油三酯代谢的产物。虽然在临床生化指标上,PCOS患者的甘油三酯治疗后相对于治疗前没有显著性降低,但代谢组学方法检测到的一些代谢物与甘油三酯呈正相关,并且这些代谢物与胰岛素、肥胖等关系密切。因此,LC-MS的代谢组学平台能为PCOS的临床检测提供更详细的信息。

图6

Fig. 6

图6 代谢物与临床指标的相关性分析 Fig.6 Correlation analysis of some metabolites and clinic data FSH: follicle stimulating hormone; CDCA: chenodeoxycholic acid; E2: estradiol; PRL: prolactin; T: testosterone; P: progesterone; DHEA sulfate: dehydroepiandrosterone sulfate; LH: luteinizing hormone; GCA: glycocholic acid; GDCA: glycochenodeoxycholicacid; SFA: saturated fatty acid; TG: triglyceride; LPC: lysophosphatidylcholine; LPE: lysophosphatidylethanolamine.

激素代谢异常,尤其是雄激素过高也是PCOS的主要临床表现之一。我们运用代谢组学方法能检测到4种重要的激素:硫化脱氢表雄酮、硫酸雄酮、硫化本胆烷醇酮、5 α -硫化双氢睾酮。硫化脱氢表雄酮是一个肾上腺雄激素的标志物。一些研究表明血清硫化脱氢表雄酮含量与多囊疾病关系紧密^{[ 27 ]}。因此LC-MS的代谢组学平台能为POCS的雄激素过量提供一个更为简便、灵敏的方法。