色谱  2014, Vol. 32 Issue (5): 458-463   PDF (942 KB)    
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韦寿莲
郭小君
严子军
刘永
汪洪武
邻苯二甲酸二（2-丙基庚）酯分子印迹固相萃取剂的制备及其应用
韦寿莲 , 郭小君, 严子军, 刘永, 汪洪武    
肇庆学院化学化工学院, 广东 肇庆 526061
收稿日期：2014-1-6
基金项目：广东省科技计划项目（2011B020314011）；广东省教育厅科技创新项目（2012kjcx0104）；肇庆市科技计划项目（2011C005，2013C019）.
通讯作者：韦寿莲，E-mail:weishlmary@126.com
摘要：以邻苯二甲酸二辛酯（DOP）为虚拟模板分子，α-甲基丙烯酸（MAA）为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）为交联剂，采用沉淀聚合法制备了对邻苯二甲酸二（2-丙基庚）酯（DPHP）具有高选择性的分子印迹聚合物（MIP）。用紫外分光光度法探索了不同功能单体与模板分子的结合能力，与功能单体丙烯酸（AA）相比，MAA与DOP的结合能力更强，其最佳结合的物质的量比为6：1。考察MIP对DOP、DPHP、邻苯二甲酸二甲酯（DMP）、邻苯二甲酸二丁酯（DBP）的选择吸附性能，发现该聚合物对DPHP具有更高的选择吸附性。以制备的聚合物为固相萃取填料，结合HPLC分析，考察了淋洗剂与洗脱剂的种类和用量对DPHP回收率的影响。将DPHP甲醇溶液加载至萃取柱后用1 mL甲醇-水（1：9，v/v）淋洗，5 mL甲醇-乙酸（9：1，v/v）洗脱，DPHP在分子印迹固相萃取（MISPE）柱上的回收率达到96.8%，而在非印迹固相萃取（NISPE）柱上的回收率仅为52.9%。将建立的MISPE-HPLC方法应用于测定兔口服DPHP后不同时间点兔血清中DPHP的浓度，发现其血药浓度的最大值为5.88 μg/mL，达峰值时间为4 h，DPHP加标回收率为90.0%~92.0%，相对标准偏差小于5%。
关键词： 虚拟模板     分子印迹聚合物     固相萃取     邻苯二甲酸二（2-丙基庚）酯     兔血清    
Preparation and application of di(2-propylheptyl) phthalate molecularly imprinted solid-phase extraction sorbent
WEI Shoulian , GUO Xiaojun, YAN Zijun, LIU Yong, WANG Hongwu    
Faculty of Chemistry and Chemical Engineering, Zhaoqing University, Zhaoqing 526061, China
Received: 2014-1-6
Abstract: The molecular imprinted polymer (MIP) with high selectivity to di(2-propylheptyl) phthalate (DPHP) was synthesized by precipitation polymerization with dioctyl phthalate (DOP) as dummy template, methacrylic acid (MAA) as functional monomer and ethylene glycol dimethacrylate (EDMA) as cross-linker. The binding ability of the template and functional monomer was investigated by UV spectrometry. Compared with the functional monomer acrylic acid (AA), MAA showed stronger binding capacity to DOP and the best combination mole ratio of 6:1. The selective adsorption performance of MIP for DOP, DPHP, dimethyl phthalate (DMP) and dibutyl phthalate (DBP) was investigated using the prepared MIP as high performance liquid chromatographic column packing. It was found that the prepared MIP showed higher retention ability and selectivity for DPHP. Using the prepared MIP as a solid-phase extraction (SPE) sorbent (MISPE), the effects of the type and amount of washing solvent and elution solvents on the recovery of DPHP were investigated. After optimization of MISPE profile, the DPHP extraction recovery of 96.8% was obtained when the following procedures were applied to MISPE cartridge: conditioning with 2 mL methanol, loading with 1 mL methanol, washing with 1 mL methanol-water (1:9, v/v), eluting with 5 mL methanol-acetic acid (9:1, v/v). The recovery of DPHP on non-imprinted polymer (NIP) cartridge was only 52.9%. The developed MISPE-HPLC method was applied to determine the concentrations of DPHP in rabbit serum at different time points after oral administration. It was found that the maximal concentration (cmax) and time (tmax) were 5.88 μg/mL and 4 h, respectively. The recoveries of spiked DPHP in rabbit serum ranged from 90.0% to 92.0% with the relative standard deviations less than 5%。
Key words: dummy template     molecular imprinted polymer (MIP)     solid-phase extraction (SPE)     di(2-propylheptyl) phthalate (DPHP)     rabbit serum    

邻苯二甲酸酯类化合物是塑料加工行业中广泛使用的增塑剂。该类化合物往往具有致癌性、致畸性、致突变性等毒性[ 1 ],是一种环境激素,会干扰人体内分泌特别是生殖功能[ 2 ],导致男性生育能力下降,增加女性患乳腺癌的几率。目前该类物质在化妆品、玩具、医用器械、食品包装中广泛存在。邻苯二甲酸二(2-丙基庚)酯(DPHP)是一种毒性相对较低的增塑剂[ 3 ],2006年,BASF公司宣布将DPHP纳入亚洲“塑料产品创新计划”。因此,有必要研究DPHP的药代动力学,以探讨其在动物体内的代谢规律和特点。

由于动物体液组成复杂,干扰性较大,而DPHP含量极低,因此提高样品净化方法的选择性显得尤为重要。血液的净化处理常采用固相萃取(SPE),但由于常规SPE柱采用C18为填料,萃取选择性较差,因此制备高选择性的固相萃取填料可望提高其萃取选择性。

分子印迹聚合物(MIP)是一类采用分子印迹技术合成的对目标化合物具有特异性识别作用的聚合物[ 4 ]。目前,MIP作为固相萃取填料已成功应用于生化分离[ 5 ]、食品[ 6,7 ]、医药[ 8,9 ]、环境[ 10,11 ]、毒物[ 12 ]等各个分析领域。但是MIP在模板的洗脱过程耗时较长且往往不能将模板分子完全除去,在实际应用中易发生“模板泄露”,影响目标分子的定量分析,因而限制了其在痕量分析中的应用。研究人员引入“虚拟模板”[ 13,14,15 ]的概念,使用与目标分子结构相近的物质为模板分子,很好地解决了“模板泄露”的问题。本研究以DPHP的类似物邻苯二甲酸二辛酯(DOP)为虚拟模板分子,合成对DPHP有选择性识别能力的MIP,并将MIP作为固相萃取填料应用于兔血清中DPHP的测定。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

Agilent 1200液相色谱仪(美国Agilent公司),GBC UV/VIS 916紫外-可见分光光度计(澳大利亚GBC公司),可控恒温水浴锅GKC 2100A(上海锦屏仪器仪表有限公司),KUDOS SK8200H超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司),Philips XL-30扫描电子显微镜(荷兰Philips公司)。

邻苯二甲酸二辛酯、邻苯二甲酸二(2-丙基庚)酯(DPHP)、邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)标准品(德国Dr. Ehrenstorfer公司);丙烯酸(AA)和 α -甲基丙烯酸(MAA)(天津市科密欧化学试剂有限公司);乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA,阿拉丁试剂公司);偶氮二异丁腈(AIBN,天津市百世化工有限公司);甲醇、乙腈(色谱纯,广州化学试剂公司);其他试剂均为分析纯(广州化学试剂公司)。实验用水为屈臣氏蒸馏水,购自本地超市。

1.2 功能单体与模板分子的结合实验

分别取浓度为0.4 mmol/L 的丙烯酸、甲基丙烯酸与等体积的0.1 mmol/L DOP混合均匀,用UV考察DOP吸收峰的变化,优化功能单体。将DOP与功能单体分别按物质的量比为1 ∶ 1、1 ∶ 2、1 ∶ 4、1 ∶ 6、1 ∶ 8混合均匀,用UV考察DOP吸收峰变化,优化功能单体与模板分子的配比。

1.3 分子印迹聚合物的制备

取模板分子DOP 0.5 mmol、MAA 3 mmol,溶于30 mL甲苯中,超声脱气30 min,置于冰箱过夜。加入15.0 mmol EDMA,0.12 mmol AIBN,超声处理5 min。在冰浴中充氮脱气5 min,交替进行3次,以生料带密封。置于60 ℃恒温水浴中聚合24 h,制得胶状聚合物,用甲醇-乙酸(9 ∶ 1,v/v)在索氏提取器中抽提24～72 h,至紫外-可见光谱检测不出模板分子为止,再用乙腈反复沉降以除去过细颗粒及乙酸至聚合物呈中性,真空干燥后得到MIP。空白聚合物(NIP)除不加模板分子外其他操作均和制备MIP相同。

1.4 选择性实验

取300 mg MIP采用湿法装填至规格为150 mm×4.6 mm色谱柱管,抽真空,拧紧柱头后连接到高效液相色谱泵上,用甲醇冲柱至基线平稳。用甲醇配制DOP、DMP、DPHP、DBP均为5.00 mg/L 的混合标准溶液,进样测定。流动相为甲醇-水(90 ∶ 10,v/v),流速为0.5 mL/min,检测波长为225 nm,进样量为20 μ L。

1.5 MISPE柱的制备及萃取条件优化

称取200 mg MIP,均匀装填入商品SPE柱管(6 mL)中,并在聚合物上用脱脂棉压实,制备MISPE柱。用2 mL甲醇活化,将1 mL 5.00 mg/L DOP、DMP、DPHP、DBP混合标准溶液上样,考察不同用量的不同溶剂淋洗、洗脱对DOP、DMP、DPHP、DBP萃取回收率的影响,优化萃取条件。同时称取200 mg NIP,在相同的条件下制备NISPE柱,并在相同的条件下用NISPE柱进行对照实验,比较MISPE柱与NISPE柱的萃取效果。

1.6 兔血清样品的制备

将采集的兔血浆静置30 min,在 3000 r/min 条件下离心10 min分离血清。准确吸取0.5 mL兔血清样品于离心管中,加入4 mL乙腈,涡旋2 min,在 3000 r/min 条件下离心10 min,取上清液,用氮气吹干后用1 mL甲醇溶解；将其上样至MISPE柱中，用1 mL甲醇-水(1 ∶ 9,v/v)淋洗，5 mL甲醇-乙酸(9 ∶ 1,v/v)洗脱，所得萃取液经N2吹干,残渣以0.50 mL甲醇溶解，供HPLC测定。

1.7 HPLC条件

色谱柱:XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μ m);流动相:甲醇-水(95 ∶ 5,v/v);流速:0.5 mL/min;检测波长:225 nm;进样量:20 μ L。

2 结果与讨论
2.1 功能单体种类的选择

采用紫外光谱考察不同功能单体与DOP的结合能力。结果发现,在DOP中分别加入等量的AA和MAA后,最大吸收波长向长波方向移动,吸收峰强度稍增大。这是由于两种功能单体与DOP之间均存在氢键作用,导致最大波长红移[ 16 ]。与DOP-AA结合物比较,在230.82 nm波长处,DOP-MAA结合物的波长红移和吸收峰强度增大的幅度更大,说明DOP与MAA之间的氢键作用更强,结合能力更好。这是因为AA和MAA属于 α ,β -不饱和羰基化合物,MAA的 α 位比AA的 α 位多一个取代烷基的缘故。故本文选择MAA为最佳功能单体。

2.2 功能单体与模板分子结合比例的选择

将模板分子DOP和功能单体MAA按物质的量比分别为1 ∶ 1、1 ∶ 2、1 ∶ 4、1 ∶ 6、1 ∶ 8混合,得到的紫外光谱图见图1。随着MAA浓度的增加,最大吸收波长红移幅度越来越大。当DOP和MAA达到1 ∶ 6时,增加幅度减小。这是因为随着功能单体浓度的增大,结合位点增多[ 17 ],但当MAA与DOP结合达到饱和状态时,结合位点不再增加;过量的MAA可能在空间上阻碍其与DOP的组装,同时MAA可能会发生自身分子间缔合作用[ 18 ],从而影响聚合过程的进行。故本文选用DOP和MAA的物质的量比为1 ∶ 6。

图1 不同物质的量比的DOP与MAA作用的UV光谱图 Fig.1 UV spectra of DOP-MAA at different molar ratios
2.3 聚合物的红外光谱图分析

MIP与NIP的红外光谱图的峰形基本相同,说明模板分子已基本被洗脱,且两者具有明显的羟基、羰基、甲基和C=C伸缩振动吸收峰。3443.5 cm-1和957.6 cm-1为-OH的特征吸收峰,2957.4 cm-1、1458.0 cm-1和 1388.0 cm-1为聚合物骨架上-CH3的伸缩振动峰,1730.4 cm-1的强吸收峰为C=O伸缩振动峰,1635.0 cm-1的弱吸收峰为C=C伸缩振动峰,1258.7 cm-1为交联剂中酯键C-O伸缩振动峰,1158.0 cm-1为C-O-C伸缩振动峰。对比MIP和NIP的红外光谱图发现,MIP各吸收峰的强度比NIP的大,说明DOP上的酯基与功能单体中的羧基通过氢键作用实现了印迹聚合;且MIP在 3443.5 cm-1、1158.3 cm-1和957.6 cm-1处的吸收峰较NIP相应的吸收峰向低频移动,这归因于功能单体与模板分子间的氢键作用使电子云密度平均化,从而导致伸缩振动频率向低频率方向移动。

2.4 聚合物的扫描电镜分析

图2为MIP和NIP的扫描电镜图。从图2中可观察到MIP颗粒大小均匀,排列紧密,分散性好;而NIP结构松散,分散性较差,有团聚现象。这可能是在模板分子存在下,模板分子与功能单体以氢键和静电作用预聚合、自组装形成聚集体,在交联剂、引发剂作用下进一步聚合成整齐有序的形态,而NIP因无聚结核分子存在,故生成物呈无序状排列。

图2 (a)MIP和(b)NIP的扫描电镜图 Fig.2 Scanning electron micrographs of (a) MIP and (b) NIP
2.5 MIP聚合物的选择性

由1.4节的实验测得DOP、DMP、DPHP、DBP的保留因子k、选择因子 α 如表1所示。由表1可知,MIP对DPHP的保留因子为0.896,选择因子为5.71,明显高于其他几种类似物,说明以DOP作为虚拟模板分子合成的聚合物对DPHP有较高的选择性。

表1 分析物在MIP柱上的保留时间(tR)、保留因子(k)及选择因子( α ) Table 1 Retention times (tR),retention factors (k) and selectivity factors ( α ) of the analytes on the MIP column under experimental conditions
2.6 MISPE对DPHP萃取条件的优化

固定淋洗剂用量为1 mL,分别考察了甲醇-水(1 ∶ 9,v/v)、甲醇-水(9 ∶ 1,v/v)、甲醇为淋洗剂对DPHP萃取回收率的影响。结果发现这3种体系的萃取回收率分别为97.6% 、96.3%和44.0% 。这是因为DPHP难溶于水,易溶于有机溶剂,故淋洗剂中甲醇含量越高,越容易将DPHP淋洗下来,萃取回收率越低。故选择甲醇-水(1 ∶ 9,v/v)为淋洗剂。


分别考察了甲醇、甲醇-乙酸(9 ∶ 1,v/v)作为洗脱剂对DPHP萃取回收率的影响。结果发现其相应的萃取回收率分别为90.8% 、96.3% 。这是因为在甲醇中加入少量乙酸后,乙酸的羟基能够破坏DPHP与印迹聚合物之间的氢键作用,从而提高其萃取回收率。故选用甲醇-乙酸(9 ∶ 1,v/v)为洗脱剂。当洗脱剂用量为5 mL时,萃取回收率达到96.8% ;继续增加用量,回收率无明显增大,反而导致聚合物发生溶胀。故选择洗脱剂用量为5 mL。

2.7 MISPE柱与NISPE柱萃取效果的比较

表2为MISPE柱与NISPE柱对1 mL 5.00 mg/L DOP、DMP、DPHP、DBP混合溶液的萃取效果。由表2可知,在MISPE柱上4种邻苯二甲酸酯的萃取回收率大小顺序为DPHP＞DOP＞DBP＞DMP,且DPHP的萃取回收率明显高于其他几种类似物,说明MIP的印迹空腔对DPHP的匹配度较高,特异识别性强。这可能是因为MIP中功能单体与目标分子的识别主要以氢键作用和疏水作用为主。4种邻苯二甲酸酯与MAA之间的氢键作用相似,而疏水作用的大小顺序为DPHP＞DOP＞DBP＞DMP。NISPE柱对4种物质的萃取回收率相近且不高,这是由于NISPE柱对目标分子的作用主要是物理吸附。故MISPE柱可用于萃取DPHP。

表2 分析物在MISPE柱和NISPE柱上的萃取回收率 Table 2 Extraction recoveries of the analytes on MISPE and NISPE columns
2.8 线性方程和检出限

配制DOP、DMP、DPHP、DBP质量浓度在1.0～40 mg/L 范围的混合标准溶液,按1.7节条件进行HPLC分析。DOP、DMP、DPHP、DBP的峰面积(A)与质量浓度c (mg/L)呈良好的线性关系(见表3),检出限(以S/N=3计)分别为0.1、0.2、0.1、0.4 mg/L。图3为5.0 mg/L的DOP、DMP、DPHP、DBP混合标准溶液的HPLC色谱分离图,可见4种分析物分离良好。

表3 4种分析物的线性方程、相关系数和检出限 Table 3 Linear equations,correlation coefficients and limits of detection of the four analytes

图3 4种分析物混合标准溶液的HPLC色谱图 Fig.3 HPLC chromatogram of a mixed standard solution of the four analytes HPLC conditions were the same as given in Table 2.


3 应用
3.1 空白兔血清

图4a为空白兔血清的色谱图。与图3比较,发现空白兔血清在DPHP保留时间附近存在基质干扰。空白兔血清经MISPE萃取后,在DPHP的保留时间附近已无干扰峰出现(见图4b),说明血样经固相萃取预处理可以有效地消除基质干扰。空白兔血清加标试验测定结果见表4。从表4结果发现,DPHP的回收率在90.0% ～92.0% ,RSD小于5% ,表明本方法准确可靠,可用于实际样品测定。

图4 (a)未经处理和(b)经MISPE柱处理的空白兔血清样品的HPLC谱图 Fig.4 HPLC chromatograms of blank rabbit serum (a) without and (b) treated by a MISPE column HPLC conditions were the same as given in Table 2.
表4 经MISPE柱处理的空白兔血清中3个加标水平下DPHP的回收率(n=3) Table 4 Recoveries of DPHP spiked in a blank rabbit serum at three levels treated by MISPE column (n=3)
3.2 兔血清中DPHP含量的测定

准确称取0.5 g DPHP,用1 mL乙醇溶解。4只雌性健康家兔,体重(2.5±0.5) kg,禁食10 h,于第二天早上7点口服DPHP溶液。分别于口服后1、2.5、3、4、5、6.5、8 h各抽取1 mL静脉血,按照1.6节方法进行样品前处理,按1.7节的条件进行HPLC分析。根据兔血清中DPHP的含量测定结果,得到DPHP血药浓度-时间曲线图(见图5)。由图5可见,前3 h兔血中DPHP浓度较低,兔体内对DPHP的吸收较慢;3 h后吸收增快,于4 h达到峰值,峰值浓度为5.88 μ g/mL。与Bernard等[ 19 ]给大鼠灌胃邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)后所得的血药浓度-时间曲线相类似(3 h达峰值,其峰值浓度为8.8 mg/L)。4 h后DPHP代谢速度大于吸收速度,4～6.5 h DPHP浓度呈现快速下降趋势,6.5～8 h趋于平缓,8 h后血清中已检测不到DPHP,说明DPHP增塑剂在兔血液中无蓄积,与Williams等[ 20 ]的研究结论一致。

图5 兔血清中DPHP的浓度-时间曲线 Fig.5 Concentration-time profile of DPHP in rabbit serum
4 结论

本文以DOP为虚拟模板,MAA为功能单体,EDMA为交联剂合成了对DPHP具有高选择性的分子印迹聚合物,对DPHP的选择因子为5.71。用其作固相萃取填料可有效消除兔血清中基质对DPHP测定的干扰,加标回收率为90.0% ～92.0% ,相对标准偏差小于5% 。建立的MISPE-HPLC方法选择性高、准确、灵敏,可应用于复杂动物体内DPHP的药代动力学研究。

参考文献
[1]Hu X X, Han Z H, Liu B Y, et al. Environmental Science and Management (胡雄星, 韩中豪, 刘必寅, 等. 环境科学与管理), 2007, 32(1): 37
[2]McKee R H, Butala J H, David R M, et al. Reprod Toxicol, 2004, 18: 1
[3]Guo H R, Zhu L Q. Plastic Additive (郭浩然, 朱丽琴. 塑料助剂), 2006(6): 36
[4]Cai Y Q, Mou S F. Journal of Instrumental Analysis (蔡亚岐, 牟世芬. 分析测试学报), 2005, 24(5): 116
[5]Zhang Y, Hu Y L, Li G K. Journal of Instrumental Analysis (张毅, 胡玉玲, 李攻科. 分析测试学报), 2008, 27(2): 215
[6]Sadeghi S, Jahani M. Food Chem, 2013, 141(2): 1242  
[7]Guo Z, Hao T, Shi L, et al. Food Chem, 2012, 132(2): 1092  
[8]Chen F F, Shi Y P. Chinese Journal of Chromatography (陈方方, 师彦平. 色谱), 2013, 31(7): 626
[9]Smet D D, Kodeck V, Dubruel P, et al. J Chromatogr A, 2011, 1218(8): 1122  
[10]Nong S Y, Lin F H, Huang X J, et al. Chinese Journal of Chromatography (农舒予, 林福华, 黄晓佳, 等. 色谱), 2012, 30(11): 1133
[11]Zhao W, Sheng N, Zhu R, et al. J Hazard Mater, 2010, 179: 223  
[12]Lian Z, Wang J. Environ Pollut, 2013, 182: 385  
[13]Yu J C C, Lai E P C. Toxins, DOI: 10.3390/toxins2061536
[14]Feás A, Seijas J A, Vázquez-Tato M P, et al. Anal Chim Acta, 2009, 631(2): 237  
[15]Zheng Y Q, Cao Z, Guo H B, et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry (郑亚秋, 曹湛, 郭宏斌, 等. 分析化学), 2010, 38(1): 95
[16]Zhang X G, Zhu Q J, Hu P. Food Science (张孝刚, 朱秋劲, 胡萍. 食品科学), 2011, 32(21): 128
[17]Yan L S, Jing J, Huang Z M, et al. Chinese Journal of Analysis Laboratory (颜流水, 井晶, 黄智敏, 等. 分析试验室), 2006, 25(5): 97
[18]Huo J P, Si S H, Wang Y H, et al. Chinese Journal of Synthetic Chemistry (霍佳平, 司士辉, 王颜红, 等. 合成化学), 2010, 18(2): 159
[19]Astill B, Barber E, Lington A, et al. Environ Health Persp, 1986, 65: 329
[20]Williams D T, Blanchfield B J. Bull Environ Contam Toxicol, 1974, 11(4): 371