色谱  2014, Vol. 32 Issue (5): 485-492   PDF (1447 KB)    
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陈达炜
吕冰
丁颢
邹建宏
杨欣
赵云峰
苗虹
超高效液相色谱-同位素稀释高分辨质谱法测定红葡萄酒中的18种农药残留
陈达炜1, 吕冰1, 丁颢1, 邹建宏2, 杨欣1, 赵云峰1, 苗虹1     
1. 卫生部食品安全风险评估重点实验室, 国家食品安全风险评估中心, 北京 100021;
2. 第二炮兵总医院, 北京 100088
收稿日期：2014-1-7
基金项目：国家“十二五”科技支撑计划（2011BAK10B06）.
通讯作者：苗虹，E-mail:miaoh@cfsa.net.cn
摘要：建立了采用超高效液相色谱-同位素稀释高分辨质谱法同时快速测定红葡萄酒中18种农药残留的方法。样品采用乙腈提取，以N-丙基乙二胺（PSA）和C18作为吸附剂的分散固相萃取法（d-SPE）进行净化，以BEH C18色谱柱进行色谱分离，分别通过高分辨质谱的全扫描/实时二级质谱扫描（full scan/ddms2）和目标选择离子监测（targeted SIM，tSIM）模式进行定性筛查和定量检测。以多菌灵-D4、毒死蜱-D10、吡虫啉-D4、甲氧虫酰肼-D9、嘧霉胺-D5和戊唑醇-D6为内标进行内标法定量，有效地降低了样品基质的影响。待测物在0.5~50 μg/L范围内呈良好的线性关系，相关系数（r）大于0.999。18种农药残留的检出限（LOD）为0.5 μg/kg，定量限（LOQ）为1.0 μg/kg。空白红葡萄酒样品在1~40 μg/kg范围内的4个加标水平的平均回收率为85.4%~117.9%，相对标准偏差为0.5%~6.1%。应用该方法对市售的红葡萄酒样品进行检测，共检出多菌灵、吡虫啉、嘧霉胺、戊唑醇和三唑醇5种农药残留，含量分别为2.6~143.0 μg/kg、0.6~0.9 μg/kg、2.1~3.1 μg/kg、0.6~3.0 μg/kg和0.6 μg/kg。该方法适用于红葡萄酒中农药残留的快速筛查和定量检测。
关键词： 分散固相萃取     同位素稀释     超高效液相色谱     高分辨质谱     农药残留     葡萄酒    
Determination of 18 pesticide residues in red wine by ultra high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry with isotope dilution technique
CHEN Dawei1, LÝ Bing1, DING Hao1, ZOU Jianhong2, YANG Xin1, ZHAO Yunfeng1, MIAO Hong1     
1. Key Laboratory of Food Safety Risk Assessment of Ministry of Health, China National Centre for Food Safety Risk Assessment, Beijing 100021, China;
2. The Second Artillery General Hospital, Beijing 100088
Received: 2014-1-7
Abstract: A method for the simultaneous determination of 18 pesticide residues in red wine was developed using ultra high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS) with isotope dilution technique. The red wine samples were extracted with acetonitrile, and the extracts were cleaned up with dispersive solid phase extraction (d-SPE) using the mixture of N-propyl ethylene diamine (PSA) and C18 powder as sorbent. The extracted components were separated on a BEH C18 column by gradient elution. The qualitative and quantitative analyses were operated under full scan/data dependent MS/MS (ddms2) and targeted selective ion monitoring (tSIM) by high resolution mass spectrometry, respectively. Carbendazim-D4, chlorpyrifos-D10, imidacloprid-D4, methoxyfenozide-D9, pyrimethanil-D5 and tebuconazole-D6 were used as the internal standards to reduce the matrix effects. The response of each pesticide showed a good linearity in the range of 0.5-50 μg/kg with the correlation coefficient more than 0.999. The limits of detection and quantification for the 18 pesticides in the spiked blank red wine were 0.5 μg/kg and 1.0 μg/kg, respectively. The recovery results with spiked blank red wine samples at the levels of 1 to 40 μg/kg were satisfactory with average recoveries of 85.4%-117.9% and the RSDs of 0.5%-6.1%. The method was applied for the determination of the red wine real samples from the market. Carbendazim, imidacloprid, pyrimethanil, tebuconazole and triadimenol were detected in the samples. The results show that the method is suitable for the rapid screening and quantitative analysis of pesticide residues in red wine.
Key words: dispersive solid phase extraction (d-SPE)     isotope dilution     ultra high performance liquid chromatography (UPLC)     high resolution mass spectrometry (HRMS)     pesticide residues     wine    

农药残留问题一直是各国及国际组织十分关注的食品安全的焦点之一,各国在严格限制高毒农药使用的同时,加强了农药最大残留限量标准的制定。我国颁布的食品安全国家标准(GB 2763-2012)《食品中农药最大残留限量》中,无论是在食品品种还是在最大残留限量方面均提出了更高的要求。目前,我国对于蔬菜水果中的农药残留制定了相关规定,但对果酒、果汁等农作物深加工产品中的农药残留还未给予足够的重视。

葡萄酒是用新鲜葡萄或葡萄汁经过发酵后生产的饮料,其营养价值高且含有氨基酸、矿物质(微量元素)、多酚等多种营养成分,适量饮用有助于人体健康[ 1 ]。然而在种植葡萄的过程中,为了提高葡萄产量，喷洒农药成为防治病虫害最为常用的手段,致使葡萄和葡萄酒中存在多种农药残留。国内外关于葡萄酒中农药残留的常用检测方法主要有气相色谱-质谱法(GC-MS)[ 2,3,4,5,6 ]和高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)[ 7,8,9 ]等。样品前处理方法主要有液液(微)萃取[ 10,11 ]、固相萃取[ 12 ]、固相微萃取[ 13,14 ]和分散固相萃取[ 3,15 ]等。在这些前处理方法中,液液萃取往往净化效果不佳,操作烦琐;而固相萃取、固相微萃取和分散固相萃取则较为简便,更适合葡萄酒的前处理。

目前,基于食品基质的复杂性以及对于目标物痕量分析的要求,同位素稀释技术在食品分析[ 16,17 ]和环境分析[ 18 ]领域得到迅速发展,保证了质谱分析结果的准确性和稳定性。本研究比较了固相萃取和分散固相萃取两种前处理方法,采用超高效液相色谱-同位素稀释高分辨质谱同时快速测定红葡萄酒中的18种农药残留。高分辨质谱的使用在很大程度上降低了出现假阳性结果的概率,而同位素稀释技术有效地降低了基质效应,从而明显提高了方法的准确性和重现性。该方法简便、快速、准确,适合红葡萄酒样品中农药残留的快速筛查和定量检测。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

Q Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱系统及Dionex UltiMate 3000快速高效液相色谱系统(Thermo-Fisher公司,美国); Supelco固相萃取装置(Sigma公司,美国);氮吹仪(Organomation公司,美国);涡旋混合器(Scientific Industries公司,美国)。

乙腈和甲醇为色谱纯(Fisher Scientific公司,美国);甲酸和甲酸铵为HPLC级(Tedia公司,美国);氯化钠和无水硫酸钠为分析纯(国药试剂有限公司,中国); 18种农药标准品(腈嘧菌酯、多菌灵、毒死蜱、嘧菌环胺、苯醚甲环唑、环酰菌胺、咯菌腈、吡虫啉、茚虫威、醚菌酯、甲氧虫酰肼、腈菌唑、戊菌唑、百克敏、嘧霉胺、喹氧啉、戊唑醇和三唑醇)的纯度均大于98%(Dr. Ehrenstorfer公司,德国);多菌灵-D4、毒死蜱-D10和戊唑醇-D6,纯度均大于98%(Dr. Ehrenstorfer公司,德国);吡虫啉-D4、甲氧虫酰肼-D9和嘧霉胺-D5,纯度均大于98%(C/D/N Isotopes Inc公司,加拿大);实验用水为超纯水,由美国Millipore公司纯水仪制备。N-丙基乙二胺(PSA)和C18粉末(天津博纳艾杰尔公司,中国); HLB固相萃取柱(Waters公司,美国)。红葡萄酒购于北京市各大超市。

1.2 农药标准溶液的配制

准确称取各农药标准品10 mg(精确至0. 1 mg)于10 mL容量瓶中,以甲醇定容,配制成1 g/L 的标准储备溶液;再以甲醇稀释，定容成10 mg/L 的标准中间液,-18 ℃贮存。用50%(v/v)甲醇将标准中间液配制成系列浓度的混合标准工作液,于4 ℃贮存。


1.3 样品处理
1.3.1 提取

取5 g样品(精确至0.01 g)于15 mL聚丙烯离心管中,加入100 μ L 1 mg/L 的混合内标溶液,涡旋混合15 s,加入5 mL乙腈,涡旋混匀,加入2 g氯化钠和4 g无水硫酸钠,涡旋混匀1 min后以 5000 r/min 离心5 min,取有机相,待净化。

1.3.2 净化

从上述5 mL有机相中准确移取上清液1 mL于15 mL聚丙烯离心管中,加入50 mg PSA、50 mg C18粉末和250 mg无水硫酸钠,涡旋混匀,以 5000 r/min 离心2 min,取上清液0.5 mL,加水定容至1 mL,过0.22 μ m有机相滤膜后注入UPLC-HRMS进行分析测定。

1.4 仪器分析条件

UPLC色谱条件:流动相A为含0.1%(v/v)甲酸和4 mmol/L 甲酸铵的水溶液,B为含0.1%(v/v)甲酸和4 mmol/L 甲酸铵的乙腈溶液。洗脱梯度:0～4 min,20%B～50%B; 4～10 min,50%B～80%B; 10～12 min,80%B～100%B; 12～15 min,100%B～20%B。进样量:5 μ L;流速:200 μ L/min;柱温:40 ℃; Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μ m)。

质谱条件:加热电喷雾离子源(HESI)温度为325 ℃;毛细管电压为3.5 kV;离子传输管温度为300 ℃;鞘气为30 unit,辅助气为10 unit。full scan/ddms2扫描模式:采集范围为100～600 Da,正离子或负离子同时采集;一级质谱分辨率(R)70000 FWHM,二级质谱分辨率 17500 FWHM;碰撞池能量(NCE)为35 eV。tSIM扫描模式:正离子或负离子同时采集,分辨率 35000 FWHM,质荷比宽度为4 Da。

2 结果与讨论
2.1 检测农药的选择

本实验中18种农药是依据欧盟国际测量评估计划(IMEP)2013年关于葡萄中农药残留考核(IMEP-37)的清单要求进行选择的。鉴于葡萄酒是以葡萄为主要原材料的加工产品,针对IMEP-37考核所规定的农药进行分析检测是有必要的。

2.2 样品前处理方法的选择

比较了HLB固相萃取法和以PSA、C18为吸附剂的d-SPE净化方法。HLB固相萃取法:直接取2 mL样品上样到已活化好的HLB柱,经4 mL水淋洗,用4 mL甲醇洗脱,洗脱液氮吹至2 mL,加水定容至4 mL(样品质量浓度相当于0.5 g/mL); d-SPE法按1.3节中方法处理(样品质量浓度相当于0.5 g/mL)。净化效果如图1所示,d-SPE法去除色素的能力较HLB柱法更好,且HLB柱洗脱较慢,繁琐耗时。同时,在加标回收试验中HLB柱法对毒死蜱的绝对回收率低于50% ,而d-SPE法对18种农药的绝对回收率均在70%以上。因此,本实验采用d-SPE法作为净化方法。

图1 d-SPE和HLB固相萃取效果的比较 Fig.1 Comparison of the clean-up effect by d-SPE and HLB
2.3 d-SPE分散剂的选择与用量

PSA、C18和石墨化炭黑(GCB)是d-SPE中较为常用的吸附剂。其中PSA能够有效地去除有机酸、金属、糖类和一部分色素;C18能够除去一些非极性物质,如脂类物质等;而GCB能够较好地除去大部分色素。文献[ 4 ]曾报道将PSA、C18和GCB作为混合吸附剂用于葡萄酒的净化,但GCB易于吸附一些含苯环的物质,从而导致其回收率偏低。本实验以PSA和C18作为吸附剂进行净化,可以去除红葡萄酒中的大部分色素,无须GCB进一步净化。

考察了PSA和C18的用量,发现PSA用量为50 mg和100 mg时的净化效果无明显差异;而当C18用量达到100 mg以上时,对非极性农药(如百克敏)有一定的吸附,导致回收率下降。故本实验采用50 mg的PSA和50 mg的C18进行d-SPE净化。

2.4 色谱-质谱条件的优化

本实验采用UPLC BEH C18色谱柱分析,因流动相的组成会影响化合物的峰形以及离子化效率,比较了液相色谱-质谱常用的乙腈-水和甲醇-水体系,结果发现效果相近。鉴于乙腈-水系统的分析时间更短,因此选用乙腈-水体系。为进一步增加离子化效率和改善化合物峰形,在体系中添加0.1%(v/v)甲酸和4 mmol/L 的甲酸铵,使目标化合物的峰形更为尖锐,从而提高方法的灵敏度。优化后的梯度洗脱程序见1.4节,在优化条件下测定的10 μ g/L 的18种农药和6种内标标准溶液的色谱图如图2所示。

图2 18种农药和6种同位素内标(10 μ g/L)的选择离子图 Fig.2 Ion chromatograms for 18 pesticides and 6 internal standards (10 μ g/L) a. carbendazim; b. imidacloprid; c. pyrimethanil; d. triadimenol; e. fludioxonil; f. carbendazim-D4; g. imidacloprid-D4; h. pyrimethanil-D5; i. azoxystrobin; j. myclobutanil; k. fenhexamid; l. tebuconazole; m. cyprodinil; n. methoxyfenozide; o. tebuconazole-D6; p. methoxyfenozide-D9; q. penconazole; r. kresoxim-methyl; s. difenoconazole; t. pyraclostrobin; u. indoxacarb; v. quinoxyfen; w. chlorpyrifos; x. chlorpyrifos-D10.

由于Q Exactive高分辨质谱仪是四极杆质谱与轨道阱(Orbitrap)质谱的串联,具有高分辨率和高灵敏度的特点。与三重四极杆质谱以母离子/子离子对为定量手段不同,Q Exactive质谱在full scan和tSIM模式下以母离子为定量离子,且具有很好的定量能力,这大大简化了质谱参数的优化,从而省去了三重四极杆质谱仪MRM的能量优化时间。以1 μ g/L 的多菌灵为例,进行full scan和tSIM两种模式扫描,结果如图3所示。两种定量模式均具有较好的灵敏度,且tSIM扫描模式由于具有更窄的质荷比范围(4 Da),从信噪比来看明显比full scan模式具有更高的灵敏度。因此本实验选用tSIM扫描模式进行18种农药的定量分析。

图3 在full scan和tSIM两种模式下1.0 μ g/L 多菌灵的色谱图 Fig.3 Chromatograms for carbendazim (1.0 μ g/L) acquired with full scan and tSIM modes
2.5 基质效应

用50%(v/v)的乙腈水溶液配制5、10和50 μ g/L 的农药混合标准溶液,同时称取空白红葡萄酒样品,按照1.3节提取净化,并对空白样品进行分析,确定其不含有目标化合物后,再用空白样品提取液配制同浓度水平的系列基质匹配标准溶液。以基质匹配标准溶液和溶剂标准溶液的目标物峰面积比值评价基质效应,比值越接近1.0,说明基质效应越弱。18种农药的基质效应如图4所示,比值均在0.85～1.00范围内,表明18种农药在红葡萄酒中存在较弱的基质抑制效应。本实验采用同位素内标法进行定量,一方面可以减少前处理所引入的误差,另一方面也能够补偿基质效应对定量分析结果的影响。

图4 在5、10和50 μ g/L 质量浓度下18种农药的基质效应 Fig.4 Matrix effects for the 18 pesticides at the mass concentrations of 5,10 and 50 μ g/L
2.6 定性筛查

本实验以Q Orbitrap高分辨质谱的full scan/ddms2模式对10 μ g/kg 加标水平的红葡萄酒中的18种农药进行快速定性筛查,以保留时间以及母离子的精确质量数和2个碎片离子的精确质量数作为定性判断依据。采用1.3节和1.4节的样品前处理和分析条件进行分析测定,得到18种农药的精确质量数和碎片离子信息见表1。

表1 10 μ g/kg 加标水平下空白红葡萄酒中18种农药的定性筛查结果 Table 1 Qualitative screening results of the 18 pesticides in the blank red wine sample spiked at 10 μ g/kg
2.7 定量方法学验证
2.7.1 线性范围和定量限

配制上述18种农药的系列混合标准溶液(0.5、1.0、2.5、5.0、10、25和50 μ g/L)进样分析,以内标法定量。其中多菌灵、毒死蜱、吡虫啉、甲氧虫酰肼、嘧霉胺和戊唑醇分别以各自对应的同位素内标进行定量；而其他12种农药依据农药结构性质、保留时间等,均以戊唑醇-D6作为内标进行定量。结果表明18种农药在0.5～50 μ g/L 范围内均呈良好的线性关系,相关系数(r)＞ 0.999。

在空白样品中添加0.5、1和2.5 μ g/kg 共3个水平的18种农药混合标准溶液,按已建立的方法测定,以3倍信噪比对应的加标水平为检出限,10倍信噪比对应的加标水平为定量限,具体结果见表2。

表2 18种农药的回归方程、相关系数、线性范围、检出限及定量限 Table 2 Regression equations,correlation coefficients (r),linear ranges,LODs and LOQs of the 18 pesticides
2.7.2 准确度和精密度

以空白红葡萄酒样品加标的回收率表示方法的准确度,以回收率的相对标准偏差(RSD)表示方法的精密度。向空白红葡萄酒样品中添加农药混合标准溶液,使加标水平分别为1、10、20、40 μ g/kg,每个加标水平制备6份平行样品,摇匀,放置2 h,按照1.3节方法处理,其回收率和相对标准偏差结果见表3。18种农药的平均回收率为85.4% ～117.9% ,相对标准偏差为0.5% ～6.1% 。空白加标回收结果说明本方法的精密度和准确度良好。

表3 空白红葡萄酒样品加标回收试验结果(n=6) Table 3 Results of recovery test of the spiked blank red wine samples (n=6)
2.8 实际样品的测定

采用本文所建立的方法对市售的5种红葡萄酒进行测定,结果见表4。在所测定的5种红葡萄酒中共检出多菌灵、吡虫啉、嘧霉胺、戊唑醇和三唑醇5种农药残留,含量分别为2.6～143.0 μ g/kg、0.6～0.9 μ g/kg、2.1～3.1 μ g/kg、0.6～3.0 μ g/kg 和0.6 μ g/kg。其中检出多菌灵的4个阳性样品的色谱图如图5所示。

表4 5种红葡萄酒实际样品中检出的农药残留(n=2) Table 4 Pesticide residues detected in five red wine real samples (n=2)

图5 检出多菌灵的4个阳性样品的色谱图 Fig.5 Chromatograms for carbendazim in four positive samples
3 结论

采用超高效液相色谱-同位素稀释高分辨质谱检测技术建立了红葡萄酒中18种农药残留的快速定性筛查和定量检测方法。本方法采用d-SPE对红葡萄酒样品进行净化,节省前处理时间,简便快速。通过高分辨质谱的full scan/ddms2和tSIM扫描模式快速进行定性筛查和准确的定量检测,与三重四极杆质谱相比有效地简化了质谱参数的优化。选用6种同位素内标进行同位素稀释法测定,有效克服了样品前处理及其基质效应所带来的误差,提高了方法的准确性和重现性。经实际样品检测的考察,该方法简单、快速、准确,适合于红葡萄酒中农药多残留的快速定性筛查和定量检测。

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