色谱  2014, Vol. 32 Issue (7): 741-745   PDF (799KB)    
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夏广辉
沈伟健
余可垚
吴斌
张睿
沈崇钰
赵增运
卞筱泓
许激扬
气相色谱-负化学源质谱法测定蜂蜜和王浆中4种杀虫剂的残留
夏广辉1, 沈伟健2, 余可垚2, 吴斌2, 张睿2, 沈崇钰2, 赵增运2, 卞筱泓1, 许激扬1     
1. 中国药科大学生物化学教研室, 江苏 南京 210009;
2. 江苏出入境检验检疫局食品实验室, 江苏 南京 210001
收稿日期：2014-1-26
基金项目：国家质检总局科技计划项目（2011KJ39，2012KJ31，2012IK167）.
通讯作者：许激扬，E-mail：jiyang_xu@sina.cn.
摘要：建立了气相色谱-负化学源质谱（GC-NCI/MS）测定蜂蜜和王浆中4种杀虫剂残留量的方法。蜂蜜样品由乙酸乙酯提取、乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）净化，而王浆样品经乙腈-水（1：1，v/v）提取、C18固相萃取柱净化，采用GC-NCI/MS测定，外标法定量。结果表明：在50~500 μg/L范围内4种农药的线性良好；所有农药的LOD在0.12~5.0 μg/kg之间，LOQ在0.40~16.5 μg/kg之间；在10、15、20 μg/kg 3个添加水平下，4种农药的平均回收率在78.2%~110.0%之间，且RSD均小于14%。所有农药的测定均没有出现干扰峰。该方法简单、快速，准确度、精密度和选择性高，抗干扰能力强，可用于蜂蜜和王浆中这4种农药的快速检测。
关键词： 气相色谱-负化学源质谱     杀虫剂     蜂蜜     王浆    
Determination of four insecticide residues in honey and royal jelly by gas chromatography-negative chemical ionization mass spectrometry
XIA Guanghui1, SHEN Weijian2, YU Keyao2, WU Bin2, ZHANG Rui2, SHEN Chongyu2, ZHAO Zengyun2, BIAN Xiaohong1, XU Jiyang1     
1. Department of Biochemistry, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China;
2. Food Laboratory, Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Nanjing 210001, China
Received: 2014-1-26
Abstract: A method was developed for the determination of four insecticide residues in honey and royal jelly by gas chromatography-negative chemical ionization mass spectrometry (GC-NCI/MS). The honey and royal jelly samples were treated with different preparation methods as the result of the different components. The honey sample was extracted with ethyl acetate and cleaned up with primary second amine, and the royal jelly sample was extracted with acetonitrile-water (1:1, v/v), and cleaned up with a C18 solid-phase extraction column. Finally, the extracts of the honey and royal jelly were analyzed by GC-NCI/MS in selected ion monitoring (SIM) mode separately. External standard calibration method was used for quantification. The linearities of calibration curves of the four insecticides were good with the correlation coefficients greater than 0.99 in the range of 50-500 μg/L. The limits of the detection (LODs) of the four insecticides were in the range of 0.12-5.0 μg/kg, and the limits of the quantification (LOQs) were in the range of 0.40-16.5 μg/kg. The recoveries of the four insecticides spiked in honey and royal jelly at three spiked levels (10, 15 and 20 μg/kg) were in the range of 78.2%-110.0%, and the relative standard deviations (RSDs) were all below 14%. The sensitivity and selectivity of this method were good with no interfering peaks. The proposed method is simple, quick and effective to analyze the four insecticide residues in honey and royal jelly.
Key words: gas chromatography-negative chemical ionization mass spectrometry (GC-NCI/MS)     insecticides     honey     royal jelly    

蜂蜜和蜂王浆作为主要的蜂产品,具有较高的营养和保健价值[1],市场需求较大。但在养殖过程中蜜蜂幼虫容易染上各种疾病,例如由雅氏瓦螨引起的蜂螨病。幼虫染病后就会大量的死亡,给蜂农带来巨大的经济损失,因此蜂农就会对蜂巢喷洒农药以起到预防虫病的作用。目前氟胺氰菊酯是使用最广泛的抗螨虫药,其他的农药如氟氯苯菊酯和氯氰菊酯[2,3,4]以及有机磷类农药蝇毒磷[5]等也有一定的使用。农药的不合理使用导致这些农药在杀灭寄生虫的同时,往往也会污染蜂产品。如果长期食用这些被农药污染的蜂产品,人们的健康将面临严重的危险[6,7]。许多国家都规定了蜂产品中杀虫剂的最大残留量(MRL),如美国环保部规定蜂蜜中的蝇毒磷的MRL要小于0.1 mg/kg,日本肯定列表规定蜂蜜中氟胺氰菊酯、氯氰菊酯、氟氯苯菊酯的MRL分别为0.01、0.005、0.05 mg/kg,我国农业部也规定了蜂蜜中氟胺氰菊酯、氟氯苯菊酯的MRL分别为0.05、0.01 mg/kg。

目前文献中报道的用于分析这些农药的检测技术主要有GC[2, 8, 9, 10]、GC-MS[11,12,13,14,15]、HPLC[16]、LC-MS[17]等。由于色谱-质谱联用仪器的普及,GC、LC技术因样品前处理复杂、不能定性确证,在农药残留检测中的应用已经越来越少。应用LC-MS技术分析蝇毒磷时灵敏度高、选择性好,但是在分析弱极性的氟胺氰菊酯、氯氰菊酯、氟氯苯菊酯等拟除虫菊酯时灵敏度较差,尤其分析氟氯苯菊酯的灵敏度很差。GC-MS技术对于农药分析具有一定的优势,尤其近几年随着对化学电离源(CI)研究的深入,发现其对带负电的化合物具有高灵敏度，且对绝大部分基质组分和柱流失均无响应[14],使得化学电离源在农药残留分析中具有很高的价值。由于本文要分析的目标物质均含有强电负性的氰基或卤族元素,因此选用负化学电离源(NCI)技术分析这些农药尤为合适。蜂王浆成分复杂,而考察王浆中农药残留的文献较少,目前尚未见有文献采用NCI技术进行蜂蜜和蜂王浆中蝇毒磷、氟胺氰菊酯、氟氯苯菊酯、氯氰菊酯残留量的检测。

1 实验部分
1.1 试剂和材料

标准品:蝇毒磷(coumaphos)、氯氰菊酯(cypermethrin)、氟胺氰菊酯(fluvalinate)、氟氯苯菊酯(flumethrin)(德国Dr. Ehrenstorfer公司)。

正己烷、乙腈(色谱纯,美国Burdick公司);乙酸乙酯(色谱纯,美国Sigma-Aldrich公司);氯化钠(分析纯,南京化学试剂有限公司);乙二胺-N-丙基硅烷填料(PSA)(40～60 目,美国UCT公司); C18固相萃取柱(美国Sepax公司)。

1.2 仪器和设备

Agilent 7890A GC-5975C MS(配有CI源)(美国Agilent公司); XW-80A旋涡混匀器(上海医科大学仪器厂); KH-500B超声仪(昆山禾创超声仪器有限公司); BUCHI R-200旋转蒸发仪(瑞士BUCHI公司); SIGMA2-16K台式离心机(德国赛多利斯公司)。

1.3 标准储备液和工作液的配制

分别准确称取10 mg(精确到0.1 mg)蝇毒磷、氯氰菊酯、氟胺氰菊酯、氟氯苯菊酯标准品,置于10 mL容量瓶中,用乙酸乙酯溶解并定容,分别配成1 g/L 的农药单标准储备液，于4 ℃冰箱中冷藏保存(有效期12个月)。

分别取1.0 mL农药单标准储备液于同一个10 mL容量瓶中,并用正己烷稀释至10 mL,配制成100 mg/L 的混合标准储备液,依次逐级稀释成10、1、0.1 mg/L 的系列标准工作液，于4 ℃冰箱中冷藏保存(有效期6个月)。

1.4 样品前处理
1.4.1 蜂蜜

称取样品5.0 g(精确至0.01 g)于50 mL离心管中,加入5 mL水和5 g氯化钠,涡旋2 min溶解;加入25 mL乙酸乙酯,涡旋2 min;超声提取15 min,于 8 000 r/min 下离心,吸取上层清液;再用25 mL乙酸乙酯提取1次;合并提取液于150 mL平底烧瓶中,于40 ℃下旋转蒸发至干;加入1 mL正己烷溶解,转移入10 mL试管中,加入50 mg PSA,涡旋2 min,并过0.45 μ m有机相滤膜于进样瓶内,待GC-NCI/MS分析。

1.4.2 蜂王浆

准确称取5.0 g(精确至0.01 g)均质的王浆样品于50 mL离心管中,加入20 mL乙腈-水(1 ∶ 1,v/v)混合溶剂,超声提取15 min,于 8 000 r/min 下离心4 min,取上清液待净化。

将C18柱安装在固相萃取装置上,依次加入4 mL正己烷-乙酸乙酯(1 ∶ 1,v/v)混合溶剂、3 mL乙腈、3 mL水进行活化;将待净化的上清液过C18柱,真空抽干;加入4 mL正己烷进行洗脱,收集洗脱液于10 mL玻璃试管中,氮气吹干;加入1 mL正己烷复溶,转移至进样瓶内,待GC-NCI/MS分析。

1.5 气相色谱条件

色谱柱:HP-5ms弹性石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μ m);柱温升温程序:初始温度100 ℃,以20 ℃/min 升至300 ℃,保持13 min。载气:高纯(纯度≥99.999% )氦气;载气流速:1.0 mL/min;进样口温度:300 ℃;接口温度:250 ℃;进样量:1 μ L;进样模式:不分流进样,1.50 min后开分流阀。

1.6 质谱条件

离子源:NCI;电离能量:174.7 eV;离子源温度:150 ℃;四极杆温度:150 ℃;溶剂延迟时间:4.20 min;反应气:高纯(纯度≥99.99% )甲烷气;数据采集模式:SIM；离子碎片信息见表1。

表1 4种农药GC-NCI/MS分析的保留时间、线性方程、相关系数、定量和定性离子 Table 1 Retention times (tR),linear equations,correlation coefficients (r2),quantification ions, identification ions of the four insecticides by GC-NCI/MS
2 结果与讨论
2.1 提取与净化

蜂蜜的主要成分有糖类、水分、有机酸类、维生素类物质等[18]。其中糖类物质约占75%以上,主要为葡萄糖和果糖,它们均为极性物质。蜂蜜中的脂溶性组分如有机酸等[19],采用乙酸乙酯提取时会进入萃取液,给农药的准确分析带来干扰。PSA可以吸附这些有机酸,本文方法加入50 mg PSA净化以消除干扰。

王浆是一类组分较复杂的蜂产品,主要成分包括水分、蛋白质、糖类、氨基酸、脂肪酸、维生素等物质[20,21]。其中蛋白质约占12% ～15% ,且种类有12种以上,此外还有许多小肽类物质。蛋白质的表面有许多游离的羟基,这些羟基间的键合会使蛋白质形成许多囊状结构。这些囊状的蛋白质分子会包裹农药分子,从而给农药的准确定量分析带来干扰。因此王浆样品前处理中最关键的步骤就是沉降蛋白质。蛋白质的沉降剂有许多种,如强碱、强酸类的氢氧化钠、高氯酸、三氯乙酸等,但是这些强碱、强酸在使蛋白质变性的同时,也会破坏农药结构中的酯键,导致农药回收率较低(只有30% ～50% )。在分析王浆中4种目标农药时,最常用的沉降剂为有机溶剂,如乙腈、二氯甲烷、氯仿等,有机溶剂沉降蛋白质的效果很好且不会破坏基质中的农药结构。由于乙腈既可以作为蛋白质沉降剂,又可作为提取溶剂,从简化操作的目的,本文选择乙腈为沉降剂。

2.2 线性关系、检出限及选择性

配制50～500 μ g/L 5个系列浓度的混合标准溶液并按上述GC-MS条件进行测定,以农药定量离子的峰面积对质量浓度做标准曲线,得到4种农药的线性方程及相关系数,由表1可见方程的线性关系良好(相关系数均大于0.99)。

结合加标水平为10 μ g/kg 的蜂蜜和王浆样品的总离子流(TIC)谱图,根据S/N=3和S/N=10确定检出限和定量限,蜂蜜和王浆中4种农药的检出限和定量限见表2。4种农药的LOD范围为0.12～5.0 μ g/kg,LOQ为0.40～16.5 μ g/kg,方法的灵敏度大大低于采用其他技术如GC、GC-EI/MS、LC和LC-MS等的结果[8, 10, 16, 17],且均可以满足对外贸易中的检测要求。

表2 蜂蜜和王浆两种基质中4种农药的检出限和定量限 Table 2 LODs and LOQs of four insecticides in honey and royal jelly

采用电子轰击电离技术分析有较高沸点的氟氯苯菊酯时,由于受到柱流失的影响,检测基线会抬高,导致检测氟氯苯菊酯的灵敏度很差,谱图中几乎看不到出峰。由于NCI不会对柱流失成分产生响应且对氟氯苯菊酯有特异的响应,因此应用NCI检测蜂蜜和王浆基质中氟氯苯菊酯的灵敏度很高。

本文测定的4种杀虫剂均含有强电负性的基团,如氟胺氰菊酯、氟氯苯菊酯、氯氰菊酯均含有强电负性的氰基和卤族元素氟或氯,蝇毒磷含有强电 负性的氯元素。由于NCI只对含电负性基团的化合物有响应,且随着电负性的增强,响应增强,因此NCI对这4种杀虫剂具有很高的选择性。而蜂蜜和王浆的基质组分无电负性,在NCI下没有响应,也不会带来干扰。如蜂蜜和王浆中10 μ g/kg 加标样的TIC谱图(图1c和图1e)所示,目标峰附近都没有出现干扰峰。

图1 (a) 0.1 mg/L 4种农药混合标准溶液、(b)空白蜂蜜样品、 (c)10 μ g/kg 加标水平的蜂蜜样品、(d)空白王浆样品和(e)10 μ g/kg 加标水平的王浆样品的总离子色谱图 Fig.1 Total ion chromatograms of (a) a mixed standard solution of the four insecticides (0.1 mg/L),(b) a blank honey sample,(c) a honey sample spiked with the standards at 10 μ g/kg,(d) a blank royal jelly sample and (e) a royal jelly sample spiked with the standards at 10 μ g/kg Peaks: 1. coumaphos; 2. cypermethrin; 3. fluvalinate; 4. flumethrin.
2.3 准确度与精密度

在阴性的蜂蜜和王浆样品中分别添加10、15和20 μ g/kg 3个水平的混合标准溶液,按照上述提取、净化和检测步骤,每个添加水平平行测定6次。依据测得浓度和加标浓度的比值计算4种农药的平均回收率并计算RSD。

处理王浆样品时,蛋白质的沉降有时候不是很彻底,残留的蛋白质仍会包裹农药分子,再加上前处理过程中的其他因素均会导致农药的损失。本文分别采用溶剂校正曲线和萃取液校正曲线来计算加标水平为10 μ g/kg 的王浆样品中4种农药的回收率,结果如图2所示,蝇毒磷和氯氰菊酯采用溶剂校正曲线计算得到的回收率都在50%以下,而采用萃取液校正曲线得到的结果可以达到80%以上；很显然,采用萃取液校正曲线计算王浆中4种农药的回收率更为准确,王浆中4种农药的平均回收率在78.2% ～93.1%之间,且RSD≤12.2%(见表3)。

图2 采用两种校正曲线计算10 μ g/kg 王浆样品中4种农药的回收率 Fig.2 Recoveries of the four insecticides spiked in royal jelly at 10 μ g/kg calculated by two kinds of calibration curves Peaks

表3 3个添加水平下4种农药在蜂蜜和王浆样品中的平均 回收率和相对标准偏差(n=6) Table 3 Average recoveries and the relative standard deviations of the four insecticides spiked in honey and royal jelly at three levels (n=6)

与王浆相比,蜂蜜基质组成较为简单且前处理操作过程也较为简单,采用溶剂校正曲线计算蜂蜜中4种农药的回收率,平均回收率在79.2% ～110.0%之间,且RSD≤13.1%(见表3),结果令人满意,因此在计算蜂蜜中4种农药的回收率时,采用溶剂校正曲线即可满足残留分析要求。

3 结论

本文应用GC-NCI/MS技术测定了蜂蜜和王浆中的蝇毒磷、氟胺氰菊酯、氟氯苯菊酯、氯氰菊酯的残留量。4种农药在两种基质中的LOD范围在0.12～5.0 μ g/kg,LOQ为0.40～16.5 μ g/kg 之间。在10、15、20 μ g/kg 添加水平下,4种农药的平均回收率在78.2% ～110.0%之间,且RSD均小于14% 。本方法具有简单、快速、灵敏度高、选择性好、抗干扰能力强等特点,可以成为检测蜂蜜、王浆中该4种农药的常规检测技术,且满足国际贸易检测要求。

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