TurboFlow在线净化液相色谱-串联质谱仪(美国Thermo Fisher公司),由CTC多功能自动进样器(配有100 μ L定量环)、两个耐压125 MPa的四元梯度液相泵、六通阀切换装置、多元柱切换装置和TSQ Quantum Ultra三重四极杆质谱仪组成;PT2100型均质器(瑞士Kinematica公司);高速冷冻离心机(德国Sigma 4K-18);漩涡振荡器(美国Vortex-Genie2);超声波清洗器(KQ-500E)。甲醇、乙腈均为色谱纯;水为Milli-Q高纯水。标准物质:炔诺酮、17 α -羟基孕酮、甲羟孕酮、乙酸甲地孕酮、孕酮、醋酸美伦孕酮,德国Dr. Ehrenstorfer公司,纯度≥99% 。内标标准物质:炔诺酮-D6、孕酮-D9,纯度≥99% 。

精确称取适量标准品,用乙腈配制成100 mg/L 的标准储备液和内标标准储备液。分别取标准储备液用乙腈配制成质量浓度为1 mg/L 的混合标准工作液;分别取内标标准储备液用乙腈配制成质量浓度为1 mg/L 的混合内标工作液。用混合标准工作液和内标工作液配制系列标准溶液,孕激素质量浓度范围在0.1～50 μ g/L 范围内,内标质量浓度为5 μ g/L。

用蠕动泵以10 μ L/min 向质谱系统注入1 mg/L 的混合标准溶液来确定分析物的最佳质谱条件。在ESI⁺扫描方式下分别对分析物进行一级全扫描(Q1),得到各标准物质的母离子,分析物的分子离子峰[M+H]⁺响应值最高,无[M+Na]⁺和[M+NH₄]⁺。分别选择各母离子进行子离子扫描(Q3)得到特征碎片离子并优化碰撞能量。选择响应值高、稳定且无干扰的Q1/Q3离子对为定量和定性离子对,其优化的参数见表2。

一般以乙腈、甲醇、乙酸乙酯及其他不同比例的混合提取液提取孕激素,提取液用固相萃取柱净化。本实验根据牛奶样品的特点及孕激素的化学性质,考察了甲醇、乙腈、乙酸乙酯、1%三氯乙酸-乙腈(7 ∶ 3,v/v)4种提取液的提取效果,其回收率结果见表3。结果表明乙酸乙酯作提取剂时回收率最低；1%三氯乙酸-乙腈(7 ∶ 3,v/v)其次；甲醇和乙腈的回收率相当;但甲醇提取后溶液放置一段时间后会有白色絮状物析出,说明甲醇沉淀蛋白效果较差,乙腈作提取剂时回收率稳定,且蛋白沉淀效果最好。所以,选择乙腈作为提取溶剂。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 不同提取溶剂的回收率结果(n=5) Table 3 Recoveries with different extraction solvents (n=5) % Compound Methanol Acetonitrile Ethyl acetate 1% trichloroacetic acid solution-acetonitrile (7 ∶ 3,v/v) 19-Norethindrone 85.1±7.1 91.1±6.4 55.1±10.1 67.1±6.7 17 α -Hydroxyprogesterone 89.1±6.8 89.7±5.9 78.1±8.1 80.1±5.9 Medroxyprogesterone 90.2±5.9 91.1±6.8 64.1±7.4 82.1±5.5 Megestrol acetate 88.6±6.7 87.9±4.6 56.1±7.6 78.1±7.8 Progesterone 87.9±7.5 89.5±7.3 57.1±5.1 84.1±8.0

表3 不同提取溶剂的回收率结果(n=5) Table 3 Recoveries with different extraction solvents (n=5) %

在线固相萃取是用液相泵驱动不同的溶液使分析物在不同阶段实现在在线净化柱上的保留、洗脱并尽可能地淋洗掉干扰组分。选择恰当的在线净化柱和每步的流动相组成是在线净化条件优化的关键。孕激素极性较弱,反相硅胶型的C18柱和极性修饰的C18-P柱以及聚合物型的Cyclone和极性修饰的Cyclone-P柱均可有效保留孕激素；但Cyclone-P柱更易洗脱,流动相中有机相比例在60%时就可将分析物完全洗脱；使用较低比例的有机相会减小进入分析柱后产生的溶剂化效应,改善峰形。故选择Cyclone-P柱为在线净化柱。

在线净化过程主要包括上样、洗脱转移和淋洗。选择Cyclone-P柱为在线净化柱,实验采用不接分析柱分流进质谱的方式,优化每一步的分析条件。上样溶液比较了10 mmol/L 乙酸铵-0.02%乙酸水溶液和0.5%甲酸水溶液,结果显示用10 mmol/L 乙酸铵-0.02%乙酸水溶液作流动相时得到的色谱峰形较好。在洗脱转移这一步骤,对10 mmol/L 乙酸铵-0.02%乙酸水溶液和乙腈的使用比例进行了考察,如图1所示,当乙腈的使用比例小于50%时,洗脱效果明显变差,因此选定乙腈比例为60%。淋洗这一步骤是分析物在分析柱分离和质谱检测过程中,由净化泵带着洗脱能力较强的溶剂对净化柱进行淋洗,并用洗脱溶剂充满洗脱环以备下一个样品的分析。方法选择丙酮-乙腈-异丙醇(1 ∶ 1 ∶ 1,v/v/v)作为强洗脱溶剂,充分淋洗净化柱,绝大部分杂质可淋洗掉,进样500余次后在线净化柱仍能有效净化分析物。

图1

Fig. 1

图1 洗脱剂中乙腈体积比不同时的MRM图 Fig.1 MRM chromatograms under different volume ratios of acetonitrile in elution solvent Not connected to the analytical column. A: 10 mmol/L ammonium acetate-0.01% acetic acid aqueous solution; B: acetonitrile.

在流动相的选择上,实验比较了甲醇和乙腈,结果表明，甲醇做流动相时分析物的信号明显增加。在梯度的优化上,因在洗脱转移时在线净化流路与HPLC流路合并,两路混合后在线净化流路中的有机相对分析物的保留行为包括色谱峰形、保留时间均有明显影响,故在此步骤应设置高的HPLC流速且高水相比例。实验发现当HPLC流动相起始水相比例高于80%时可有效稀释合并流路的有机相,但水相过高会延长分析时间。综上考虑,方法选择了表1的梯度洗脱条件。在优化的净化分析条件下,其MRM色谱图如图2所示。

图2

Fig. 2

图2 孕激素及内标物的多反应检测(MRM)色谱图 Fig.2 MRM chromatograms of analytes and internal standards

实验采用Matuszewski等^{[ 18 ]}建立的基质效应确认方法,即对比样品提取净化后的基质加标溶液和标准品溶液的响应值来考察方法的基质效应。当比值等于或接近1时,表明不存在基质效应的影响;大于1,表明存在离子增强作用;小于1,表明存在离子抑制作用。实验在5 μ g/L 水平用牛奶提取液配制的基质标准溶液与用乙腈配制的标准溶液的响应值进行了对比,结果发现比值均在0.9左右(见表4: Ratio-1),说明存在一定的基质效应影响。但经同位素校正后,标准溶液中分析物与内标物的比值和基质标准溶液的分析物与内标物的比值基本一致(见表4: Ratio-2),表明用同位素内标稀释法可有效消除基质效应的影响。所以,采用溶剂配制系列标准溶液,内标法校正分析结果。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 基质效应考察结果 Table 4 Results of matrix effect test Compound Response/105 Ratio-1 Ratio-2* Milk Solvent 19-Norethindrone 3.28 3.56 0.92 1.03 17 α -Hydroxyprogesterone 3.87 4.21 0.92 1.01 Medroxyprogesterone 4.65 5.13 0.91 1.02 Megestrol acetate 5.21 5.65 0.92 1.02 Progesterone 5.26 5.84 0.90 0.99 Melengestrol acetate 4.58 5.14 0.89 0.98 Norethindrone-D6 0.90 1.02 0.88 - Progesterone-D9 6.54 7.21 0.91 - *The ratio calibrated by internal standard.

表4 基质效应考察结果 Table 4 Results of matrix effect test

用乙腈配制系列标准溶液,在选定的色谱和质谱条件下进样分析。以分析物峰面积与内标峰面积的比值对标准工作溶液中被测组分的质量浓度作线性回归,其线性范围、线性方程和线性相关系数见表5。由结果可知方法在0.1～50 μ g/L 范围内呈良好线性,线性相关系数在 0.9992～0.9999 之间。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 线性范围、线性方程和相关系数(R) Table 5 Linear ranges,linear equations and correlation coefficients (R) Hormone Linear equation R 19-Norethindrone Y=0.163+0.513X 0.9993 17 α -Hydroxyprogesterone Y=0.0863+0.684X 0.9999 Medroxyprogesterone Y=0.0504+0.142X 0.9994 Megestrol acetate Y=0.0464+0.150X 0.9992 Progesterone Y=0.0227+0.0255X 0.9999 Melengestrol acetate Y=0.0168+0.0227X 0.9997 Linear range: 0.1-50 μ g/L. Y: peak area ratio of analyte to internal standard. X: mass concentration of analyte,μ g/L.

表5 线性范围、线性方程和相关系数(R) Table 5 Linear ranges,linear equations and correlation coefficients (R)

根据最终样液所代表的试样量、定容体积以及测定时所受的干扰情况,确定牛奶中6种分析物的测定低限(LOQ)为0.5 μ g/kg。

用牛奶样品做添加回收和精密度试验,样品添加不同浓度的标准溶液后,按1.2节方法进行提取、净化和测定,分析结果见表6。3个添加水平的回收率在90.8% ～107.5%之间,相对标准偏差在6.3% ～11.8%之间,方法回收率高,稳定性好。

对市售的10种牛奶及进口的乳清粉进行抽样分析,发现样品均含有孕酮,含量在1.7～2.6 μ g/kg 之间,其他5种孕激素均未检出。

本文建立了在线净化液相色谱-串联质谱测定牛奶中6种常见孕激素类物质含量的方法。方法采用乙腈提取,提取液直接进样,在线净化液相色谱-串联质谱测定,同位素内标法定量。方法的LOQ为0.5 μ g/kg,满足国内外的限量要求,方法简单快速,回收率高,重现性好,已应用在本实验室的日常检验中。