色谱  2014, Vol. 32 Issue (6): 566-572   PDF (985KB)    
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陈国松
张晓燕
杨雯筌
沈崇钰
陈惠兰
张睿
液相色谱-串联质谱法测定花粉中的链霉素和双氢链霉素
黄娟1,2 , 殷耀1, 徐锦忠3, 刘艳1, 陈国松2, 张晓燕1, 杨雯筌1, 沈崇钰1, 陈惠兰1, 张睿1    
1. 江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心, 江苏 南京 210001;
2. 南京工业大学理学院, 江苏 南京 210009;
3. 江苏中谱检测有限公司, 江苏 南京 210061
收稿日期：2014-2-17
基金项目：质检公益项目（200810099）；质检SN行业标准制订项目（2011B288K）.
通讯作者：黄娟,Tel:(025)52345187,E-mail:huang-juan@yeah.net.
摘要：建立了花粉中链霉素（streptomycin，STR）与双氢链霉素（dihydrostreptomycin，DHS）的高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）检测方法。样品经提取液提取、三氯甲烷沉淀蛋白后，用C18固相萃取柱进行富集净化，采用HPLC-MS/MS对目标物进行定性确证和定量分析。在Protemix WCX-NP5色谱柱（100 mm×2.1 mm，5 μm）上以5%（v/v）甲酸、20 mmol/L醋酸铵和甲醇为流动相进行梯度洗脱分离；质谱采集模式为电喷雾正离子监测模式。链霉素和双氢链霉素的检出限（以信噪比（S/N）=3计）均为5 μg/kg，定量限（以S/N=10计）均为10 μg/kg；在10~200 μg/L的质量浓度范围内呈现良好的线性关系，相关系数（r）大于0.99。本底空白的松花粉、玉米花粉、茶花粉、葵花粉、油菜花粉、杂花粉等6种基质中10、20、50 μg/kg添加水平下的加标回收率范围为76.8%~100.3%，精密度范围为3.70%~12.6%。该方法无需使用对LC-MS联用仪容易造成污染的七氟正丁酸，且方法准确可靠，适用于大部分花粉基质的测定。
关键词： 固相萃取     高效液相色谱-串联质谱     链霉素     双氢链霉素     花粉    
Determination of streptomycin and dihydrostreptomycin in pollens by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
HUANG Juan1,2 , YIN Yao1, XU Jinzhong3, LIU Yan1, CHEN Guosong2, ZHANG Xiaoyan1, YANG Wenquan1, SHENG Chongyu1, CHEN Huilan1, ZHANG Rui1    
1. Animal, Plant and Food Inspection Center of Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Nanjing 210001, China;
2. College of Science, Nanjing University of Technology, Nanjing 210009, China;
3. Jiangsu Sinography Testing Co., Ltd., Nanjing 210061, China
Received: 2014-2-17
Abstract: A method was established for the determination of streptomycin (STR) and dihydrostreptomycin (DHS) in pollens based on high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS). The sample was extracted and cleaned-up by a C18 solid phase extraction cartridge. The separation was carried out on a Protemix WCX-NP5 column (100 mm×2.1 mm, 5 μm) with a gradient elution using 5% (v/v) formic acid, 20 mmol/L ammonium acetate and methanol as mobile phases. The analysis of streptomycin and dihydrostreptomycin was performed under electrospray positive ionization mode. The limits of detection (LOD, S/N=3) and limits of quantification (LOQ, S/N=10) for the both were 5 μg/kg and 10 μg/kg, respectively. Good linearities (r >0.99) were achieved for the target compounds over the range of 10-200 μg/L. The recoveries at three spiked levels (10, 20, 50 μg/kg) in the blank matrices, such as pollen pini, corn pollen, camellia pollen, sunflower pollen, rape pollen and bee pollen, were from 76.8% to 100.3% with the relative standard deviations varied from 3.70% to 12.6%. The method is accurate, practical, and can be applied to most of the contaminated matrices. With this method, heptafluorobutyric acid is not required as mobile phase which is harmful to MS spectrometer.
Key words: solid phase extraction (SPE)     high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS)     streptomycin     dihydrostreptomycin     pollens    

花粉为蜜蜂从显花植物花蕊内采集的花粉粒,混合了蜜蜂分泌的多种活性成分[ 1 ],如22种氨基酸、14种维生素、30多种常量和微量元素、94种活性酶、辅酶、植物蛋白等多种生长素、抗衰老物质,而且这些营养物质大多以游离状态存在,易为人体吸收和利用。花粉具有健脑增智提神、护肤美容、抗衰老、防治心血管病、防治前列腺疾病等作用,因此是国际上公认的迄今人们发现的营养成分和功效最完全的物质,被誉为“浓缩的营养库”[ 2 ]。近年来,各国对于蜂花粉的进口需求逐渐增大,对其质量要求也在不断增加。

链霉素(STR)、双氢链霉素(DHS)是一类广谱氨基糖苷类抗生素。在兽医学和畜牧业领域常常被用于治疗细菌性感染,对蜜蜂中较常见的一种疫病 污仔病具有很好的疗效[ 3 ]。链霉素的长期使用会导致动物体内药物的蓄积,从而通过食物链进入人体及生态系统。众所周知,链霉素最易伤害听觉神经,严重时会导致耳聋;对肾脏也有毒性。链霉素分子中链霉糖部分的醛基被还原成伯醇基后就成为双氢链霉素,其抗菌效能与链霉素大致相同,但对听觉神经的毒性比链霉素还要大。蜂农为了防治蜜蜂幼虫病,常常会不科学地使用链霉素或双氢链霉素[ 4 ],与蜂蜜蜂王浆这些常见蜂产品一样,蜜蜂在加工花粉时,蜜蜂器官的分泌物参与了加工和酿制过程,如果蜜蜂饲养过程中使用了链霉素或双氢链霉素,那么花粉同样也可能存在抗生素残留问题。

国内外标准以及文献中对链霉素和双氢链霉素的检测针对的基质多是蜂蜜、蜂王浆以及奶制品、水产品、饲料、肉制品等[ 5,6,7,8,9 ],但对于花粉中的链霉素和双氢链霉素还未见相应的检验方法,并且国内外也未见相关的文献报道。

目前国内外对于链霉素和双氢链霉素的检测方法有微生物法[ 10 ]、酶联免疫法[ 11 ]、气相色谱-质谱法[ 12 ],以及近年来多采用的液相色谱法[ 13,14,15 ]和液相色谱-质谱法[ 16,17 ]等。微生物方法存在菌种不易筛选,检测时间长,稳定性差以及精确度和灵敏度低等缺点。酶联法虽有较高的敏感性,但常产生假阳性结果,所以常用来进行初筛检测。链霉素具有较强的极性,不易挥发,气相色谱法中常需衍生化。另外,链霉素的结构中因缺少发色基团和荧光基团,液相色谱法中也常需进行柱前或柱后衍生,这些衍生化方法不仅操作麻烦,稳定性也不高。近年来,在兽药残留检测方面,HPLC-MS/MS技术的应用越来越广泛,其在抗基质干扰能力、准确定性以及灵敏度方面具有较强的优势,但对于链霉素和双氢链霉素的检测来说,还是离不开七氟正丁酸或三氟乙酸这类的离子对试剂[ 18,19,20,21 ]。该试剂为非挥发性离子对试剂,长期使用易致LC-MS离子源喷雾口堵塞,同时对于其他项目的负离子检测有较强的离子抑制作用。本文建立了一种适用于多种花粉基质,同时可避免采用离子对试剂的检测链霉素与双氢链霉素残留量的HPLC-MS/MS方法。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

Thermo Vantage液相色谱-串联三重四极杆质谱联用仪,配备电喷雾电离源(ESI)(美国Thermo公司); N-EVAP氮吹仪(美国Organomation公司); XW-80A涡旋混匀器(上海医科大学仪器厂); SLGMA2-16K高速离心机(Sigma-Aldrich公司); Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司); KQ-250DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司); SPE固相萃取装置(美国Agilent公司)。

链霉素、双氢链霉素(纯度≥98% ,Dr. Ehrenstorfer公司);甲醇、磷酸、正己烷、三氯甲烷、磷酸钠(分析纯,南京化学试剂公司);甲醇(色谱纯,Merck公司);甲酸(色谱纯,CNW公司);醋酸铵(色谱纯,ROE Scientific公司);庚烷磺酸钠(分析纯,REGIS公司);叔丁基甲基醚(分析纯,国药集团化学试剂有限公司); C18小柱(500 mg,Supelco公司);实验用水均为Milli-Q超纯水系统制备。

1.2 标准溶液的配制

标准储备液:分别准确称取10 mg链霉素和双氢链霉素标准品于10 mL容量瓶中,用甲醇-水(3 ∶ 7,v/v)溶液稀释定容,得质量浓度为1.0 g/L 的储备液。于0～4 ℃下冷藏储存备用。

混合标准中间液:分别吸取上述标准储备液,用甲醇-水(3 ∶ 7,v/v)逐级稀释成质量浓度为10.0 mg/L 的标准中间液,于0～4 ℃下冷藏储存备用。

标准工作液:取混合标准中间液,用20 mmol/L 醋酸铵溶液稀释成质量浓度为1.0 mg/L 的标准工作液,现用现配。

1.3 溶液的配制

提取液:准确称取10.1 g庚烷磺酸钠和4.1 g磷酸钠,用水溶解并转移至 1000 mL容量瓶中,加入5 mL磷酸,用水定容至刻度。

叔丁基甲基醚-正己烷(4 ∶ 1,v/v)溶液:准确量取400 mL叔丁基甲基醚,加入100 mL正己烷,混合均匀。

0.5%(v/v)甲酸溶液:准确量取5 mL甲酸,加入至 1000 mL容量瓶中,用水定容至刻度。

5% (v/v)甲酸甲醇溶液:准确量取5 mL甲酸,加入至100 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度。

20 mmol/L 醋酸铵溶液:准确称取1.54 g醋酸铵,用水溶解并转移至 1000 mL容量瓶中,用水定容至刻度。

甲醇-水(3 ∶ 7,v/v)溶液:准确量取300 mL甲醇,加入700 mL水,混合均匀。

1.4 样品前处理
1.4.1 提取

称取2 g(精确到0.01 g)花粉样品,置于50 mL具塞塑料离心管中,加入提取液20 mL、三氯甲烷3 mL,于涡旋混匀器上混合3 min,然后置于超声振荡器中超声15 min,于 8000 r/min 高速离心5 min。取上层清液收集于塑料离心管中,待净化。

1.4.2 净化

将C18小柱(预先依次用5 mL甲醇、5 mL水活化)连接于20 mL塑料针筒下，将样液全部通过C18小柱，当样液在小柱上还剩约2 mL时，加入5 mL水淋洗。去除针筒，加压抽干约3 min,加3 mL叔丁基甲基醚-正己烷(4 ∶ 1,v/v)溶液继续淋洗小柱，弃去流出液;加压抽干约5 min,加入5 mL甲醇洗脱,全程过柱流速控制在1～2滴/s。洗脱液置于45 ℃下氮气吹干;加入20 mmol/L醋酸铵溶液1.0 mL溶解残渣，充分涡旋混合后过0.45 μ m水相滤膜，供LC-MS/MS测定。

1.4.3 基质提取标准溶液的制备

称取5份2 g(精确至0.01 g)阴性花粉样品于50 mL具塞塑料离心管中,分别加入标准工作液10、20、50、100、200 μ L,余下操作同1.4.1节和1.4.2节。

1.5 色谱及质谱条件

色谱条件:色谱柱为Protemix WCX-NP5柱(100 mm×2.1 mm,5 μ m);柱温为35 ℃;流动相A相为甲醇,B相为20 mmol/L 醋酸铵溶液,C相 为0.5%甲酸溶液;梯度洗脱程序见表1;流速为0.35 mL/min;进样量为25 μ L。

表1 流动相梯度洗脱程序 Table 1 Gradient program of mobile phases

质谱条件:离子源为ESI;扫描方式为正离子扫描;毛细管电压为2.5 kV;气帘气为氮气,压力为0.060 MPa;辅助气为氮气,流量为5.0 L/h;碰撞气为氩气,压力为0.2 Pa(1.5 mTorr);离子源温度为350 ℃;加热源温度为500 ℃;检测方式为多反应监测(MRM)。链霉素和双氢链霉素母离子及质谱碎片信息见表2。

表2 链霉素和双氢链霉素的母离子、子离子和碰撞能量 Table 2 Parent ions,daughter ions and collision energies for streptomycin (STR) and dihydrostreptomycin (DHS)
2 结果与讨论
2.1 样品前处理条件的选择和优化
2.1.1 蛋白沉淀剂的选择

相关文献[ 13, 15, 22 ]报道,在蜂产品检测中常常使用高氯酸、三氯乙酸或三氯甲烷等作为蛋白沉淀剂。醋酸铅溶液也常作为重金属类沉淀剂用于蜂胶中黄酮类化合物的沉淀[ 23 ]。考虑到花粉中不仅含有较多的蛋白,还含有较多的黄酮类化合物,本文重点考察了上述4种沉淀剂在花粉前处理过程中的沉淀效果,发现:高氯酸和三氯乙酸在沉淀蛋白上有一定的效果,但是沉淀后的液体仍较混浊,会在过柱过程中导致小柱堵塞；三氯甲烷不仅沉淀了较多的蛋白质,还能同时去除花粉中脂溶性成分如脂溶性维生素、黄酮类化合物等,沉淀后的液体虽然仍然有些混浊,但相较前两者来说较为清澈,并且能够顺利地通过后面的固相萃取小柱；使用醋酸铅溶液沉淀后的样品溶液虽然非常清澈,但是在HPLC-MS/MS检测时发现,链霉素峰形很差。故本文采用三氯甲烷作为沉淀剂。

2.1.2 净化小柱的选择

目前相关的标准测定方法中链霉素、双氢链霉素的净化多采用离子交换柱或加入离子化试剂后过反相C18柱,或两者结合的方式。本文重点比较了C18柱、WCX柱以及Accell Plus CM柱。3种小柱的净化方法及链霉素和双氢链霉素的回收率见表3。实验结果表明C18柱作为净化小柱的效果最好。

表3 3种小柱净化花粉样品的条件及回收率 Table 3 SPE conditions and recoveries of STR and DHS in pollens
2.2 LC-MS/MS条件的选择
2.2.1 色谱柱的选择

链霉素和双氢链霉素为强极性分子,在反相色谱柱上的保留性极差,国家标准GB/T 21164-2007 中的高效液相色谱法采用了庚烷磺酸钠作为离子对试剂,与链霉素在酸性条件下形成离子对增强了其在反相C18色谱柱上的保留,但庚烷磺酸钠为强阴离子试剂,不仅在质谱上会抑制其他正离子的信号,而且作为难挥发性盐,它也容易在离子源中沉淀而造成毛细管堵塞。而最近又有很多报道[ 18,19,20,21 ]在质谱检测时采用了七氟正丁酸或三氟乙酸这种离子对试剂,但这类离子对试剂是一种部分挥发性试剂,仍然会在离子源中蓄积而堵塞喷雾口,而且其酸性较强,长期使用也会对仪器的配件造成一定程度的损害。同时,在实际工作中发现,在同一台液相色谱-质谱联用仪上进行多种项目检测时,该试剂对其他采用负离子模式的检测项目有较强的信号抑制,体现在七氟正丁酸根离子的质谱信号过强,掩盖了其他物质(特别是在微量检测中)的负离子信号并造成了污染,需对仪器冲洗很长时间才能消除这种抑制效应。因此积极地寻找可以代替七氟正丁酸的途径非常必要。

在选择色谱柱时,对极性较大的链霉素具有较高保留性和较好分离效果的色谱柱也非常重要。实验中比较了Inertsil ODS-3 (150 mm×4.6 mm,5 μ m)、Atlantis dC18 (150 mm×2.1 mm,5 μ m)两家不同品牌的C18色谱柱以及基于离子交换机理的Protemix WCX-NP5(100 mm×2.1 mm,5 μ m)和正相硅胶柱Atlantis Hilic (150 mm×2.1 mm,5 μ m) 4种色谱柱,在各自适用的优化色谱条件下用标准溶液对4种色谱柱进行了考察,实验表明:Inertsil ODS-3柱对于强碱性的链霉素几乎无保留,在1.7 min就出峰;Atlantis dC18色谱柱相对前者来说,保留性较好,出峰时间约在3.4 min; Protemix WCX-NP5柱也有较好的保留效果,出峰时间约为3.1 min; 在Atlantis Hilic柱上的保留时间约在4.5 min。后三者的保留性能都不错,但是结合基质发现,Atlantis Hilic柱在建议的高浓度甲酸铵流动相中柱效较好,但在低浓度甲酸铵中,虽标准溶液出峰较好,但样品的基质抑制过强,分离效果和抗干扰能力较差;而高浓度的盐即便是易挥发性盐,如果冲洗不干净或长期使用也会对质谱造成损害;Atlantis dC18柱则是柱残留效应过强,标准溶液进样后需多次用阴性样品溶液进样方能消除前次进样的待测物残留。Protemix WCX-NP5因为离子交换的分离机理,通过pH值的变化可达到吸附和解吸附作用,不仅在柱上的保留性和选择性高,而且也没有残留效应,分离效果也不错,因此本文选择Protemix WCX-NP5色谱柱进行分离。

2.2.2 质谱条件的优化

在对链霉素标准溶液进行正离子一级质谱全扫描时发现,在对应的链霉素分子离子峰([M+H]+ m/z 582)右边有一个更强信号峰m/z 614(见图1a);对该峰稍加能量轰击,m/z 582的峰信号明显增强(见图1b);再加大轰击能量后,在二级全扫描图谱(见图1c)中发现了链霉素的主要特征碎片 m/z 263.2。因此可推断,该m/z 614峰是链霉素的

图1 链霉素(a)一级质谱全扫描、(b)二级质谱全扫描(碰撞能量10 eV)和(c)二级质谱全扫描(碰撞能量27 eV)谱图 Fig.1 Spectra of (a) TIC,(b) full scan product ion (collision energy of 10 eV) and (c) full scan product ion (collision energy of 27 eV) of STR

[M+CH3OH]+峰。因此确定链霉素分子离子峰为m/z 614.3,二级碎片离子分别为m/z 582.3和263.2。

在正离子模式下对双氢链霉素一级质谱全扫描,m/z 584.3的[M+H]+信号最强(见图2a),对其进行轰击来查找二级碎片,在二级全扫描图谱(见图2b)中,发现其主要特征碎片有2个,即m/z 263.3和246.1。

图2 双氢链霉素(a)一级质谱全扫描、(b)二级质谱全扫描(碰撞能量35 eV)谱图 Fig.2 Spectra of (a) TIC,(b) full scan product ion(collision energy of 35 eV) of DHS

根据碎片离子的信号强度,本文分别选择m/z 263.2和263.3的离子碎片作为链霉素和双氢链霉素的定量离子。

2.3 方法学验证
2.3.1 基质曲线

由于花粉的基质较为复杂,不同花种的花粉基质对链霉素测定的影响也不同,本实验采用阴性茶花粉加标50 ng/g样品(重复6次测定)分别考察了在标准溶液工作曲线、基质匹配工作曲线和基质替代工作曲线(surrogated-match matrix standard)3种工作曲线下的绝对平均回收率,其中基质匹配和基质替代曲线均采用阴性茶花粉为空白基质(前者按样品处理后,在最终定容时加入各标准浓度溶液,后者则在称样后即加入各标准浓度溶液,按样品处理)。实验结果表明:同样6份样品在标准溶液曲线中STR和DHS的绝对平均回收率分别为33%和34% ,在基质匹配曲线下分别为58%和57% ,在基质替代曲线下分别为105%和96% 。由此看出,花粉的基质效应非常明显,并且花粉在提取和净化前处理过程中也存在较大的损失。目前由于暂时未能找到合适的内标物来校正链霉素、双氢链霉素,因此采用基质替代曲线作为工作曲线较为合适。

2.3.2 花种的影响

由于不同的花种有可能对链霉素的检测有不同的影响,因此本实验采用茶花粉作为阴性基质作基质替代曲线,考察了不同阴性花种样品加标50 ng/g在阴性茶花粉基质替代方法下重复6次的平均回收率。由表4可知,虽然不同的花种对检测链霉素和双氢链霉素有不同的影响,但通过基质替代曲线的校正后均可以达到规定的回收率要求。

表4 阴性茶花粉基质替代曲线下各阴性花种加标50 ng/g链霉素和双氢链霉素的平均回收率(n=6) Table 4 Average recoveries of STR and DHS in different blank pollens spiked at 50ng/g in surrogated-match matrix standard (n=6)
2.3.3 校正曲线与线性范围

采用基质替代曲线,链霉素和双氢链霉素在10～200 μ g/L 范围内呈现良好的线性关系,以标准溶液峰面积(y)对其质量浓度(x,μ g/L)作线性回归方程,链霉素和双氢链霉素的回归方程分别为y=129.947x+1151.76 (r=0.9967); y=445.917x+2059.84(r=0.9961)。

2.3.4 定量限

采用在空白基质中添加目标组分的方法,依据色谱峰的信噪比(S/N)大于10确定本方法的定量限为10 μ g/kg。

2.3.5 方法回收率和精密度

本方法分别选择阴性松花粉、玉米花粉、茶花粉、葵花粉、油菜花粉、杂花粉为样品基质进行3个水平的添加回收试验,每个水平进行6次重复试验,测定各种基质中链霉素和双氢链霉素的回收率范围及精密度。试验数据表明,方法的平均回收率为76.8% ～100.3% ,方法的相对标准偏差为3.70% ～12.6%(见表5)。空白基质及基质加标样品的选择离子流色谱图见图3。

图3 (a)松花粉空白基质和(b)松花粉加标10 μ g/kg 样品的选择离子流色谱图 Fig.3 Selected ion current chromatograms of (a) blank pollen pini and (b) the pollen pini spiked at 10 μ g/kg

表5 6种花粉中链霉素和双氢链霉素的加标平均回收率和精密度(n=6) Table 5 Spiked average recoveries and relative standard deviations (RSDs) of STR and DHS in six matrices (n=6)
2.4 实际样品的检测

采用所建立的方法对送检的15批包括荷花粉、茶花粉、油菜花粉、松花粉、杂花粉等花粉样品进行测定,仅有1批油菜花粉为链霉素阳性(测定值为86 μ g/kg),其他均未检出链霉素和双氢链霉素。

3 结论

建立了花粉中链霉素和双氢链霉素的高效液相色谱-串联质谱测定方法。采用串联质谱检测能有效地排除复杂基质对目标物的干扰并满足对目标物的定性和定量检测要求,同时还避免了采用对质谱有强离子污染的离子对试剂。

参考文献
[1]Luo Z Q, Zhang H, Wang X Y, et al. Modern Scientific Instruments (罗智强, 章虎, 王祥云, 等. 现代科学仪器), 2011, 6(3): 81
[2]Feng H, Jiao S R, Tang Y M, et al. The Food Industry (冯慧, 焦士蓉, 唐远谋, 等. 食品工业), 2011(9): 108
[3]Yang H Y, Du Y, Xu W D. Chinese Journal of Modern Applied Pharmacy (杨慧元, 杜玥, 徐伟东. 中国现代应用药学), 2011, 28(8): 751
[4]Xue X F, Wu L M, Chen L Z, et al. Food Science (薛晓锋, 吴黎明, 陈兰珍, 等. 食品科学), 2008, 29(11): 487
[5] GB/T 22995-2008
[6] GB/T 22954-2008
[7] GB/T 22969-2008
[8] GB/T 21330-2007
[9]Ministry of Agriculture. No. 1077 Bulletin of the Ministry of Agriculture of the People's Republic of China (农业部. 中华人民共和国农业部公告第1077号公告).[2014-01-05]. http://www.moa.gov.cn/zwllm/nybz/200808/t20080825_1168526.htm
[10]Guo W X, Wang G Z, Li C H, et al. Chinese Journal of Veterinary Drug (郭文欣, 王国忠, 李朝华, 等. 中国兽药杂志), 2010, 35(2): 24
[11]Yu Q F, Chen C L, Sun L N, et al. Academic Periodical of Farm Products Processing (余奇飞, 陈翠莲, 孙莉娜, 等. 农产品加工(学刊)), 2005, 11(47): 72
[12]Martina P, Michael P. J Chromatogr A, 1999, 840: 81  
[13]Edder P, Cominoli A, Corvi C. J Chromatogr A, 1999, 830: 345  
[14]Gerhardt G C, Salisbury C D, Macneil J D. J AOAC Int, 1994, 77(2): 334
[15] GB/T 21164-2007
[16]Du Y, Yang H Y, Xu W D. Chinese Journal of Antibiotics (杜玥, 杨慧元, 徐伟东. 中国抗生素杂志), 2009, 34(11): 669
[17]Liu X M, Zhao S J, Zhang J J, et al. Journal of Instrumental Analysis (刘晓茂, 赵淑军, 张进杰, 等. 分析测试学报), 2008, 27(12): 1351
[18]Mary C C, David N H. J Chromatogr B, 1998, 718: 95  
[19] GB/T 21323-2007
[20]Kaufmann A, Butcher P, Maden K. Analytica Chimica Acta, 2012, 711: 46  
[21]Wang J, Li Z H, Ni K Y, et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry (王建, 李忠红, 倪坤仪, 等. 分析化学), 2006, 34(7): 979
[22] GB/T 22945-2008
[23]Zhang X Y, Zhang R, Xu W, et al. Chinese Journal of Chromatography (张晓燕, 张睿, 许蔚, 等. 色谱), 2012, 30(3): 314