苯甲酸钠(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司;碳酸钠及氢氧化钠(优级纯)购自北京化学试剂公司;十六烷基三甲基溴化铵(CTAB,≥99% )购自美国Sigma-Aldrich公司;甜蜜素标准品(99% )购自比利时Acros Organics公司;内径75 μ m未涂敷石英毛细管购自河北永年锐沣色谱配件有限公司;甜蜜素能力验证样品由沈阳产品质量监督检验院提供;其余样品(酸梅汤、苹果醋、果脯(陈皮、蓝莓、无花果、乌梅)及酱菜小萝卜)均购自本地超市。

P/ACE MDQ型毛细管电泳仪配二极管阵列检测器(美国Beckman公司); Millipore Milli-Elix/RiOs型超纯水器(美国Millipore公司); F50A型酸度计(北京屹源电子仪器科技公司); Universal 32高速离心机(德国Hettich公司);涡旋振荡器(英国Bibby Sterilin有限公司); A 11B S25型均质仪(德国IKA公司)。

甜蜜素没有特征紫外吸收,本实验采用间接紫外法进行测定。通常将有紫外吸收的物质(探针)加到分离缓冲液中,当无紫外吸收的待测物质通过检测器时,分离缓冲液的紫外吸收下降,而产生待测物的倒峰^{[ 26 ]},通过仪器的工作站软件将倒峰转为正峰。一般使用200 nm或205 nm附近的检测波长,以获得绝大多数物质的高灵敏度检出^{[ 27 ]}。

间接紫外法中探针的选择原则是^{[ 28 ]}:探针的淌度与待分析离子的淌度越匹配越好,否则待分析离子的峰形不好或灵敏度不高。本研究在文献^{[ 22 ]}基础上分别考察了苯甲酸钠和山梨酸钾为探针时甜蜜素的检测灵敏度。

苯甲酸钠的最大紫外吸收波长为220 nm,文献^{[ 22 ]}选用254 nm作为检测波长,本实验比较了分别在200、220及254 nm检测时甜蜜素的灵敏度,如图1所示。发现200 nm检测的灵敏度最高,故以苯甲酸钠为探针时200 nm为最佳检测波长。

图1

Fig. 1

图1 苯甲酸钠为探针时20 mmol/L 甜蜜素在不同检测波长下的电泳图 Fig.1 Electropherograms of 20 mmol/L cyclamate at different detection wavelengths using sodium benzoate as probe Detection wavelengths: a. 254 nm; b. 220 nm; c. 200 nm. Capillary: 80 cm×75 μ m (effective length: 70 cm); separation buffer: 2 mmol/L sodium benzoate,10 mmol/L sodium carbonate and 0.5 mmol/L hexadecyl trimethyl ammonium bromide; sample extraction solution: pure water; separation voltage: -30 kV; injection pressure and time: 3448 Pa×18 s. 1. cyclamate.

山梨酸钾的最大紫外吸收波长为251 nm。以山梨酸钾为探针,比较了甜蜜素在200、214及251 nm检测时的灵敏度。发现随着检测波长的增加,灵敏度也越来越高,故以山梨酸钾为探针时251 nm为最佳检测波长。

保持分离缓冲液中其余组分及浓度不变,比较了2 mmol/L 山梨酸钾(检测波长:251 nm)和苯甲酸钠(检测波长:200 nm)作为探针时甜蜜素的峰高及峰形。结果表明:甜蜜素在两种探针体系中的峰高相当,但在山梨酸钾探针体系中的峰形比苯甲酸钠体系中的宽,故本研究选用苯甲酸钠为探针,且检测波长为200 nm。

探针浓度过低将因电迁移扩散而导致待测物的峰展宽,而探针的浓度过高将影响检测器的线性范围并增加基线噪声,故一般选择探针浓度2～20 mmol/L^{[ 29 ]}。保持分离缓冲液中其他组分的浓度不变,苯甲酸钠的浓度从2 mmol/L 至20 mmol/L 增大时,甜蜜素的峰迁移时间逐渐增加,且灵敏度越来越低(见图2),故苯甲酸钠的最佳浓度为2 mmol/L。

图2

Fig. 2

图2 苯甲酸钠浓度对甜蜜素测定的影响 Fig.2 Effects of the concentration of sodium benzoate on determination of cyclamate Concentrations of sodium benzoate: a. 2 mmol/L; b. 6 mmol/L; c. 10 mmol/L; d. 20 mmol/L. Other CZE conditions are the same as in Fig. 1. 1. cyclamate; other peaks: unknown.

苯甲酸的pK_a=4.20,氢氧化铵的pK_a=9.26。文献^{[ 22 ]}用10 mmol/L 苯甲酸钠与1 mmol/L 十六烷基三甲基氢氧化铵(pH 6.6)作为分离的背景电解质,所用pH 6.6既不在苯甲酸钠的缓冲范围(pH 3.2～5.2)之内,也不在氢氧化铵的缓冲范围(pH 8.26～10.26)之内。不具备缓冲能力的背景电解质使得甜蜜素的迁移时间重现性不好,故作者以 α -羟基异丁酸为内标,尽管增加了定量的重现性,但实际操作麻烦。

硼砂因紫外吸收低而成为CE中常用无机缓冲盐。实验初期,向2 mmol/L 苯甲酸钠及0.5 mmol/L CTAB背景电解质中加入10 mmol/L 硼砂。尽管甜蜜素标准溶液的峰形很好,但在实际样品分析中不能实现甜蜜素与基体中杂质峰的分离。用1 mol/L NaOH调节pH后,甜蜜素的峰与杂质峰有分离的趋势,且随着NaOH浓度的增加,分离也越来越好。当NaOH浓度增至20 mmol/L,且加入1 g/L的高分子添加剂PEG 35000后,甜蜜素与杂质峰达基线分离。此时分离缓冲液pH为10.28,显然超出了硼砂体系的缓冲范围(8.24～10.24)。尽管超出的不多,而且也得到较好的重现性,但为进一步增加分析方法的重现性,用碳酸钠代替硼砂。碳酸的pK_a2=10.25,碳酸盐的pH缓冲范围为9.25～11.25。无需调节pH,也无需添加高分子添加剂PEG 35000,仅需易于准确配制的3种组分(探针、电渗流反向剂及无机缓冲盐)组成的分离缓冲体系,即可实现实际样品中甜蜜素与杂质峰间的分离。

为避免基体干扰,本研究除检测波长的优化实验中使用标准溶液外,其余条件优化实验均选用苹果醋样品进行优化。间接紫外法需选用低浓度盐作为缓冲溶液,浓度通常控制在5～10 mmol/L 之间^{[ 27 ]}。保持其他组分的浓度不变,分别考察了5、10及15 mmol/L 碳酸钠对甜蜜素测定的影响。随着碳酸钠浓度的增加,电渗流降低,甜蜜素的迁移时间增加,焦耳热增加而导致甜蜜素的灵敏度下降且峰展宽,故碳酸钠的最佳浓度选为10 mmol/L,如图3所示。

图3

Fig. 3

图3 碳酸钠浓度对甜蜜素测定的影响 Fig.3 Effect of the concentration of sodium carbonate on the determination of cyclamate Concentrations of sodium carbonate: a. 5 mmol/L; b. 10 mmol/L; c. 15 mmol/L. Other CZE conditions are the same as in Fig. 1. 1. cyclamate; other peaks: unknown.

甜蜜素在碱性分离缓冲液中带负电,从而向阳极迁移而不能迁移至阴极的检测窗口,故需加入电渗流反向剂CTAB,以保证带负电的甜蜜素迁移方向与电渗流方向一致并能够迁移到检测窗口而被检测,从而缩短分析时间。0.5 mmol/L CTAB足以保证电渗流反向并获得稳定的电渗流^{[ 30 ]},故本研究选择向分离缓冲液中添加0.5 mmol/L CTAB。

无论从检测灵敏度还是分离度方面考虑,内径50 μ m的石英毛细管最为常用,故实验初期选用60.2 cm×50 μ m(有效长度:50 cm)的毛细管,进样时间为10 s,甜蜜素的检出限为55.6 mg/kg。为进一步增加检测灵敏度,改用75 μ m内径的毛细管,但为了避免因内径增加而导致的分离柱效下降,增加管长至80 cm (有效长度:70 cm)。这样做的好处是在尽量不降低柱效的同时还可以增加进样量,从而进一步增加检测灵敏度,而灵敏度的增加意味着将实际样品稀释更多的倍数后仍能够检测到其中的甜蜜素,同时还可通过多倍数稀释消除基体干扰,避免基体对毛细管的污染,这也是本研究能够分析食品中甜蜜素的关键所在。

优化进样时间(10、15、18、20及25 s),结果表明随着进样时间的增加,灵敏度越来越高,然而峰也越来越宽,故本研究选用进样时间为18 s。

升高电压可缩短分析时间,但过高的电压可使电流增加,产生过量的焦耳热。这些热量不能及时散失,使径向温度梯度加大,导致区带展宽,反而会使分离效率和灵敏度下降。但本实验采用的无机盐缓冲液浓度不高,仅为10 mmol/L Na₂CO₃,电压从20、25及28 kV增加至30 kV时仍未观察到峰展宽。考虑到分离时间,选择-30 kV为分离电压。

甜蜜素的水溶性好,可通过简单的用水稀释的方式将样品电导值降至低于分离缓冲液的电导值,以利于样品堆积而进一步增加检测灵敏度,基体干扰被消除的同时仍能够检测到其中的甜蜜素。与目前的国家标准GC方法^{[ 15 ]}相比,极大地减少了样品前处理时间,提高了样品分析的通量。

将甜蜜素的储备液用水逐级稀释成1.2、2.5、5、10、20、40及80 mg/L 标准工作液,在上述优化的电泳条件下依次进样分析,校正峰面积外标法定量。校正峰面积(A)与质量浓度(x,mg/L)间呈良好线性关系,线性回归方程A=286.55x+45.799,相关系数r=0.9999,线性范围1.2～80 mg/L,检出限8.9 mg/kg(S/N=3),定量限26.7 mg/kg (S/N=9)。

将2.5、10及20 mg/L 甜蜜素标准溶液分别连续进样7次,以考察仪器精密度。得到迁移时间的RSD分别为0.1% 、0.1%及0.07% ;校正峰面积的RSD分别为6.4% 、3.9%及2.0% 。按1.3.2节中的方法平行处理7份样品后进样测定,以考察方法的日内精密度,测定结果的RSD为2.6% 。每天平行测定两份样品，连续测定7天，以考察方法的日间精密度，测定结果的RSD为4.5% 。

以市售不含甜蜜素的样品为空白样品,按1.3.2节前处理方法,分别在2.5、10及20 mg/L 这3个水平进行加标回收试验,电泳图见图4。每个加标水平平行处理5份样品进行测定,结果见表1。

图4

Fig. 4

图4 空白样品加标的电泳图 Fig.4 Electropherograms of spiked blank samples a. blank sample; b. blank sample spiked with 10 mg/L cyclamate; c. 10 mg/L cyclamate standard. CZE conditions are the same as in Fig. 1. 1. cyclamate.

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 方法的加标回收率结果(n=5) Table 1 Results of the recovery test (n=5) Added/(mg/L) Average recovery/% RSD/% 2.5 93.4 6.7 10 100.3 2.0 20 101.9 2.2

表1 方法的加标回收率结果(n=5) Table 1 Results of the recovery test (n=5)

利用所建立的方法测定了甜蜜素能力验证样品,结果为0.094 g/kg(以环己基氨基磺酸计),Z比分值=-0.8,与国家标准GC法^{[ 15 ]}所测结果(0.098 g/kg)相吻合,进一步证实了本方法的准确性。在此基础上对7件食品样品进行了分析,结果见表2,未发现超标样品。其中无花果果脯样品的电泳图见图5。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 食品中甜蜜素的测定结果(n=5) Table 2 Contents of cyclamate in food samples (n=5) Sample Cyclamate in acid form/(g/kg) RSD% Syrup of plum 0.42 4.5 Apple vinegar 0.37 3.6 Dried tangerine peel 1.24 4.4 Blueberry fruit 0.72 2.1 Fig fruit 2.84 10.6 Dark plum 0.35 3.5 Pickle radish 0.07 11.6

表2 食品中甜蜜素的测定结果(n=5) Table 2 Contents of cyclamate in food samples (n=5)

图5

Fig. 5

图5 无花果果脯样品的电泳图 Fig.5 Electropherogram of fig fruit sample CZE conditions are the same as in Fig. 1. 1. cyclamate.