岛津SCL-10AVP液相色谱仪,包括SPD10Avp紫外检测器、LC-10ATvp液相泵、AT-330柱温箱、CLASS-VP色谱工作站;Mettler-Toledo酸度计。

外消旋阿卓乳酸半水物购于东京化成工业株式会社(日本东京),含量大于97.0% ;羟丙基- β -环糊精(HP- β -CD)、甲基- β -环糊精(Me- β -CD)、SBE- β -CD购于山东千汇精细化工有限公司;乙腈、甲醇为色谱纯;水为二次蒸馏水;其余试剂均为分析纯。

色谱柱:YMC-Pack ODS-A C₁₈ (250 mm×4.6 mm,5 μ m);流动相:含25 mmol/L SBE- β -CD的0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液(pH 2.68，0.1 mol/L 磷酸二氢钠溶液中滴加0.1 mol/L 磷酸溶液调节)-乙腈(90 ∶ 10,v/v);流速:0.6 mL/min;柱温:30 ℃;紫外检测波长:220 nm;进样量:20 μ L。

精密称取10.0 mg的阿卓乳酸对映体于25 mL容量瓶中,用流动相溶解、稀释至刻度,制成0.4 g/L 标准溶液,于4 ℃冰箱中冷藏保存。临用前取适量上述标准溶液,用0.45 μ m微孔滤膜过滤,即可在色谱条件下进行阿卓乳酸对映体的拆分。

实验中考察了HP- β -CD、Me- β -CD和SBE- β -CD对阿卓乳酸对映体手性分离的影响,其他色谱条件不变。在水相(pH 2.68,含20 mmol/L HP- β -CD)-乙腈(90 ∶ 10,v/v)条件下阿卓乳酸对映体没有任何分离迹象;减小乙腈的体积比,在水相-乙腈(98 ∶ 2,v/v)时或增大手性添加剂浓度至25 mmol/L 时,阿卓乳酸对映体也只有微弱的分离;将流动相有机修饰剂改为甲醇,在相同色谱条件下阿卓乳酸对映体无分离迹象且洗脱时间延长;将手性添加剂改为Me- β -CD,阿卓乳酸对映体同样无分离迹象;SBE- β -CD作为手性添加剂,在水相(pH 2.68,含20 mmol/L SBE- β -CD)-乙腈(95 ∶ 5,v/v)条件下可拆分阿卓乳酸对映体,但洗脱时间较长;增大有机修饰剂比例至水相-乙腈(90 ∶ 10,v/v),可拆分阿卓乳酸对映体且大大缩短了洗脱时间。可以看出,用HP- β -CD和Me- β -CD作为手性添加剂无法拆分阿卓乳酸对映体,只有SBE- β -CD可拆分对映体。这可能是因为阿卓乳酸对映体分子的结构、大小与SBE- β -CD的空腔更为匹配。因此,本实验选择SBE- β -CD作为手性流动相添加剂。

SBE- β -CD的浓度对对映体分离的影响见表1。随着手性添加剂SBE- β -CD浓度在5～30 mmol/L 范围内增大,阿卓乳酸对映体分离度逐渐增大。手性添加剂浓度的增大会增强其与对映体之间的相互作用,使阿卓乳酸对映体与SBE- β -CD生成的非对映体复合物之间的色谱行为差异扩大,因此增大了分离度。实验表明,在一定的SBE- β -CD浓度范围内,增大手性添加剂浓度,对映体的保留时间会缩短,但随流动相黏度的增大色谱柱压也会提高。综合考虑保留时间和分离度,选择SBE- β -CD的浓度为25 mmol/L。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 流动相中SBE- β -CD的浓度对阿卓乳酸保留因子k和分离度Rs的影响 Table 1 Effect of the concentration of SBE- β -CD in mobile phase on the retention factor (k) and resolution (Rs) of atrolactic acids c(SBE- β -CD)/ (mmol/L) k+ k- Rs Column pressure/MPa 5 6.79 6.92 0.50 11.1-11.2 10 5.75 5.99 0.95 11.6-11.7 15 5.06 5.37 1.31 12.5-12.7 20 4.46 4.77 1.51 12.6-12.8 25 4.00 4.31 1.63 12.9-13.4 30 3.64 3.96 1.77 13.4-16.6

表1 流动相中SBE- β -CD的浓度对阿卓乳酸保留因子k和分离度Rs的影响 Table 1 Effect of the concentration of SBE- β -CD in mobile phase on the retention factor (k) and resolution (Rs) of atrolactic acids

Armstrong等^{[ 16 ]}的研究表明,环糊精类衍生物与溶质间大多存在1 ∶ 1(少数情况2 ∶ 1)的包结关系。如SBE- β -CD与对映体间存在1 ∶ 1的化学计量关系,则对映体保留因子与SBE- β -CD浓度间应符合如下关系式:

将1/k对SBE- β -CD的浓度[CD]作图,若为直线即符合公式(1),说明阿卓乳酸与SBE- β -CD形成1 ∶ 1的包合物。根据表1的数据分别以两对映体的1/k对SBE- β -CD的浓度作图(见图2)。得线性回归方程依次为1/k₊=0.0051[CD]+0.1217(R²=0.9997),1/k_-=0.0043[CD]+0.1227(R²=0.9994),两条曲线都呈良好的线性关系,说明阿卓乳酸与SBE- β -CD形成了1 ∶ 1的包合物,且通过直线的截距和斜率得出了两个对映体与SBE- β -CD形成包合物过程中的包结常数分别为41.9和35.0 L/mol。

图2

Fig. 2

图2 1/k与手性添加剂SBE- β -CD浓度的关系 Fig.2 1/k plotted against the SBE- β -CD concentration

流动相pH对手性化合物,特别是自身带有酸碱基团的化合物的分离有重大影响。如表2所示,在其他色谱条件不变的情况下,在pH 2.5～4.0之间随着pH的增大,阿卓乳酸的保留时间不断减小,分离度也逐渐减小,pH 2.5～3.0时可以达到完全分离。其原因可能是阿卓乳酸本身就是一种有机酸,含有可电离的羟基和羧酸基团,pH增大使其电离程度加大,与流动相中带负电的SBE- β -CD之间的静电作用力减弱,手性识别能力随之减弱,且其分子极性增加,在反相色谱柱上难以保留,洗脱时间也大大缩短。考虑到保留时间与分离度,选用pH 2.68。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 流动相pH对阿卓乳酸分离度的影响 Table 2 Effect of pH value of mobile phase on the resolution of atrolactic acids pH k+ k- Rs 2.5 4.12 4.46 1.77 3.0 3.68 3.95 1.50 3.5 2.98 3.14 1.07 4.0 2.26 2.33 0.56 4.5 1.81 1.81 0

表2 流动相pH对阿卓乳酸分离度的影响 Table 2 Effect of pH value of mobile phase on the resolution of atrolactic acids

考察了柱温(25～40 ℃)对阿卓乳酸对映体分离的影响。如表3所示,随着柱温的升高,阿卓乳酸对映体的分离度逐渐减小,保留时间略有缩短。原因可能是温度的升高使阿卓乳酸对映体与SBE- β -CD生成的非对映体复合物的稳定性下降,其色谱行为差异随之减小。考虑到保留时间与分离度,确定最佳柱温为30 ℃。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 柱温对阿卓乳酸分离度的影响 Table 3 Effect of column temperature on the resolution of atrolactic acids Column temperature/ ℃ k+ k- Rs 25 4.11 4.38 1.75 30 4.07 4.33 1.68 35 3.98 4.27 1.55 40 3.92 4.19 1.43

表3 柱温对阿卓乳酸分离度的影响 Table 3 Effect of column temperature on the resolution of atrolactic acids

在阿卓乳酸对映体的分离中,流速从0.40 mL/min 逐渐增大到0.80 mL/min 时,阿卓乳酸对映体的保留时间逐渐缩短,峰宽变窄,但柱压不断增大,如表4所示。本文最终选取0.6 mL/min 作为流动相的最佳流速。

在优化的色谱条件下分离阿卓乳酸对映体,结果见图3。进样6次,对映体的保留时间和峰面积的RSD均小于1.5% ,说明该方法的重复性良好。

图3

Fig. 3

图3 HPLC拆分阿卓乳酸对映体的色谱图 Fig.3 Chromatogram for enantioseparation of atrolactic acids by HPLC