棉酚(gossypol)是一种存在于棉花的棉籽及棉根皮中的多酚类物质。棉酚在棉籽初榨过程中转移至油中,粗制棉籽油中棉酚含量可达1% ～1.3%[ 1 ]。长期食用棉酚较多的粗制棉籽油会引起中毒,影响生殖机能,导致不孕及胃肠障碍,甚至引起肺出血、呼吸困难等症状。棉籽油在其做成食用油前,必须经过精炼、漂白和去味3道工序,才能将其中的棉酚去除。由于棉酚毒性较大,国家标准GB 2716-2005《食用植物油卫生标准》[ 2 ]规定食用植物油中棉酚的限量标准为0.02%(200 mg/kg)。近期台湾地区爆出“黑心油”事件后,台湾地区“卫生福利部”拟将食用油中棉酚的限量规定为1 mg/kg[ 3 ]。为了测定食用植物油中游离棉酚的含量是否超标,开展对食用植物油中游离棉酚含量的测定方法研究很有必要。
目前对棉酚的检测主要采用高效液相色谱法(HPLC)[ 4,5,6 ]、薄层色谱法[ 7 ]、紫外分光光度法[ 8,9 ]等。其中分光光度法测定时选择性不强,与棉酚有相似化学结构的物质均能被同时测定,使检测结果偏高;HPLC虽然得到广泛的应用,但低于1 mg/kg 的棉酚含量已超出仪器的灵敏度极限。文献[ 10,11 ]采用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)分别测定了鲜蛋黄和棉籽中的棉酚,而利用LC-MS/MS对食用植物油中棉酚进行检测的方法未见报道。本工作所建立方法的测定低限达到1 mg/kg,能满足目前市场的检测需求,同时还能用作HPLC确证阳性样品的辅助方法。
Thermo TSQ Quantum Ultra液相色谱-串联质谱仪,配电喷雾电离源(ESI)(美国Thermo Fisher公司); Surveyor液相色谱系统(美国Finnigan公司);台式离心机(美国Thermo公司); AE260电子天平(瑞士Mettler公司);涡旋混匀器(上海医大仪器厂);超纯水净化系统(英国ELGA公司);微孔过滤膜(0.22 μ m,有机相)。
棉酚标准品:分子式为C30H30O8,相对分子质量为518.55,CAS No. 303-45-7(上海安谱科学仪器有限公司),纯度为90.5% 。准确称取经纯度折算后的棉酚10 mg,用丙酮溶解并定容至10 mL,配制成质量浓度为1 g/L 的标准储备溶液,进一步采用食用油的空白样品提取液稀释成质量浓度为10、20、40、60、100 μ g/L 的标准工作溶液(现配现用)。丙酮(色谱纯,美国TEDIA公司);乙腈和甲酸(色谱纯,西班牙Scharlau公司);水为超纯水;无水乙醇为分析纯。甲酸溶液(0.1% ):准确量取1 mL甲酸于1 L容量瓶中,加水并定容至刻度,混匀后备用。实验中所用其他试剂除特殊说明外均为分析纯。
准确称取1 g(精确至0.01 g)试样于50 mL离心管中，加入10 mL无水乙醇，剧烈振摇2 min，置于4 ℃冰箱中30 min，以 4000 r/min 离心5 min后，取约2 mL上清液过滤。准确移取1.0 mL，用无水乙醇稀释至10 mL，供LC-MS/MS测定。
色谱柱:Agilent C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,3.5 μ m);流动相:乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B);梯度洗脱程序:0～2.0 min,50%A; 2.0～4.0 min,50%A～90%A; 4.0～6.0 min,90%A; 6.0～7.0 min,90%A～50%A; 7.0～10 min,50%A。流速为0.30 mL/min;柱温为室温;进样体积为5 μ L。
电离方式:电喷雾离子源(ESI);扫描方式:负离子扫描;扫描模式:多反应监测(MRM);电喷雾电压(IS): 3500 V;离子源温度:300 ℃;毛细管温度:270 ℃;碰撞气:高纯氩气,0.2 Pa;鞘气:高纯氮气,6.5 L/min;辅助气:高纯氮气,5.0 L/min。用于定量分析的离子对为m/z 517.1/230.9(碰撞电压43 V)。
棉酚是一种黄色不稳定的多酚羟基联萘醛类化合物,难溶于水、甘油、环己烷和苯,微溶于石油醚,易溶于无水乙醇、丙酮、乙醚、氯仿、甲醇等有机溶剂。为了选择合适的标准品溶解溶剂,本文进行了优化实验。将10 mg/L 的棉酚分别保存在甲醇、丙酮、乙腈和乙醇中,连续测试5天,如图1a所示,发现棉酚溶解在丙酮中比较稳定,棉酚降解的幅度不明显。棉酚储存在乙腈、乙醇和甲醇中则不稳定,棉酚都有一定的降解,在甲醇和乙醇中尤为明显,这与文献报道相符[ 12,13 ]。因此选用丙酮作为配制标准品储备液的溶剂。
将棉酚溶解于丙酮中,配成10 mg/L 标准品溶液,于4 ℃下保存放置。将刚配制时所测得的棉酚峰面积和分别储存0、1、3、5、7、14、30、60天后的结果作图比较(见图1b)，RSD为11.5% 。从图1b还可以看出,棉酚标准溶液在14天之内比较稳定。
由于试样采用无水乙醇提取，因此用无水乙醇对标准中间液和工作液进行配制，同时对其稳定性进行考察。如图1c所示，10 mg/L标准中间液在24 h内一直处于降解过程，但6 h内降解幅度较小。因此只要保证检测在6 h内完成，对于结果的准确性还是可以得到保证。同时，由图1c可知，标准中间液及工作液需现配现用。
文献中有用丙酮[ 14 ]、无水乙醇[ 4,5,6 ]、70% (v/v)丙酮水溶液[ 15 ]、不同体积比的乙腈磷酸水溶液提取的报道。大多数文献都是采用无水乙醇提取。本文重点对上述几种溶剂的提取效率进行了考察比较。实验结果显示,4 ℃静置30 min后,丙酮与油互溶,70%丙酮水溶液与油形成乳浊液,无法实现对棉酚的有效提取。无水乙醇和乙腈与油有明显的分层,且提取效率在90%以上。相比乙腈而言,无水乙醇的毒性更小。因此,本实验采用无水乙醇进行提取。
为获得最佳提取效率,本文同时考察了提取次数对提取效率的影响。结果显示,提取一次,棉酚的提取率为80.1% ;提取两次,棉酚的提取率为83.3% ;说明随着提取次数的增加,棉酚的提取率没有明显增加。为了简化实验步骤,本文采用单次提取方式。
将棉酚标准溶液(10 μ g/L)在ESI源负离子模式下进行母离子全扫描,确定准分子离子峰;通过调节离子化温度、喷雾电压等参数后进行子离子扫描,同时对碰撞能量进行优化,得到两个干扰较小的子离子m/z 230.9和471.1。其中m/z 230.9离子的响应更高,被选作定量离子,471.1为辅助定性离子。图2分别为棉酚的碎片离子质谱图和样品的色谱图。
由于质谱在电离和扫描过程中存在基质效应的影响[ 16 ],通常需采用内标法校正或基质匹配曲线[ 17 ]来消除或减弱基质效应。本实验测试了橄榄油、菜籽油、花生油和大豆油等不同种类植物油的基质效应,结果发现这些植物油的基质对棉酚离子化有很强的增强效应,而且差别不大。 采用橄榄油空白样品溶液配制的标准工作液，其m/z 517.1/230.9定量离子对响应为采用无水乙醇配制标准溶液的211% 。因此, 为消除样品基质效应,提高定量准确性,以食用油的空白样品提取溶液作为标准溶液的稀释溶液,可使标准溶液和样品溶液具有同样的离子化条件,从而补偿样品的基质效应。结果表明棉酚在10～100 μ g/L 浓度范围均呈良好的线性关系,相关系数为0.999。如果样品中棉酚含量较高，处理后最终样液中浓度超过标准曲线范围，应用无水乙醇对其进行稀释。同时标准工作溶液应用稀释相同倍数的空白溶液进行配制。
本方法对植物油中棉酚的测定低限为1 mg/kg,同时台湾地区和祖国大陆对植物油中棉酚的最低限量分别为1 mg/kg 和200 mg/kg。因此在空白植物油中添加1、2、200 mg/kg 3个水平的棉酚标准溶液进行方法学考察(200 mg/kg添加水平下，样品稀释倍数适当加大),按优化条件提取并分析,每个添加水平平行测定6次。如表1所示,方法的平均回收率在87.4% ～100%范围内,实验室内测定的精密度(以相对标准偏差(RSD)表示)小于10% 。同时当空白植物油中添加1 mg/kg 的棉酚时,方法的平均回收率为100% ,RSD为9.8% ,信噪比大于10,因此方法的测定低限被定为1 mg/kg。可见,该方法完全能满足植物油中棉酚的测定。
通过对影响液相色谱-串联质谱分离分析的主 要因素进行优化和考察,建立了液相色谱-串联质谱法检测植物油中棉酚的分析方法。该方法测定低限为1 mg/kg,相比目前已见报道的分析方法,提高了灵敏度,也缩短了分析检测的时间。该方法快速简单,结果准确,重现性好。
2014, Vol. 32 Issue (6): 582-585
PDF (1346KB)
2014, Vol. 32 Issue (6): 582-585
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