Acquity UPLC-Quattro Premier XE超高效液相色谱-串联质谱仪,配有电喷雾源、Masslynx 4.1工作站(美国Waters公司); ASPEC XL4 4通道全自动固相萃取仪(法国Gilson公司); MS3旋涡混旋器(德国IKA公司); N-EVAP氮吹仪(12孔,美国Organomation公司); Gradient A10 Milli-Q超纯水器(Millipore公司)。

乙腈和甲醇(HPLC级,德国Merck公司),甲酸(HPLC级,美国Tedia公司); MCX固相萃取柱(30 mg/1 mL,美国Waters公司); α -龙葵碱和 α -卡茄碱标准物质(美国Sigma公司),茄啶由发芽马铃薯提取的总生物碱经2 mol/L HCl 100 ℃水解3 h后再纯化制得,分别溶于甲醇配制成1.0 mg/mL 标准贮备溶液(茄啶先溶于少量吡啶);血浆来自温州市中心血站;尿液由健康人志愿者提供。

Acquity UPLC BEH C₁₈色谱柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μ m,Waters公司),VanGuard BEH C₁₈保护柱(5 mm×2.1 mm,1.7 μ m,Waters公司);流动相A为0.1%(如无特殊说明均为体积分数)甲酸乙腈溶液,流动相B为含0.05%甲酸的5 mmol/L 乙酸铵水溶液。梯度洗脱程序:0～1.50 min,25%A～40%A; 1.50～2.50 min,40%A～55%A; 2.50～2.60 min,55%A～95%A; 2.60～4.00 min,95%A; 4.00～4.10 min,95%A～25%A; 4.10～5.50 min,25%A。流速:0.300 mL/min;柱温:45 ℃;进样体积:10 μ L。

采用ESI正离子MRM模式。ESI毛细管电压:3.0 kV;离子源温度:120 ℃;锥孔反吹气流量:50 L/h,脱溶剂温度:380 ℃,脱溶剂气流量:500 L/h,碰撞室氩气压力:0.352 Pa。其他参数见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 3种马铃薯生物碱的多反应监测参数 Table 1 MRM parameters for the three glycoalkaloids Compound Retention time/min Mass transitions (m/z) Cone voltage/V Collision energy/eV α -Solanine 1.42 868.7＞722.8 90 70 868.7＞98.2* 80 α -Chaconine 1.45 852.8＞706.8 90 70 852.8＞98.2* 85 Solanidine 2.38 398.5＞98.1* 45 45 *Quantification ion pair.

表1 3种马铃薯生物碱的多反应监测参数 Table 1 MRM parameters for the three glycoalkaloids

运行开始时,色谱柱流出液经6通切换阀切换至废液中直到1.20 min,质谱开始采集数据直到2.5 min结束,同时6通切换阀又将柱流出液切换至废液中。

取250 μ L血浆或尿液样品加入250 μ L 2%甲酸水溶液,旋涡混匀,置于自动固相萃取仪的样品架中。MCX固相萃取柱依次用1.0 mL甲醇和1.0 mL水活化;以1.0 mL/min 流速上样500 μ L样品溶液;分别用1.0 mL的2%甲酸水溶液和1.0 mL的甲醇淋洗(3.0 mL/min),抽干;3 mL含5%氨水的乙腈-甲醇溶液(6 ∶ 4)洗脱(2.0 mL/min);洗脱液于55 ℃以氮气吹干,溶于500 μ L 20%甲醇水溶液;过0.2 μ m滤膜,待测。

在电喷雾正离子检测方式下对质谱测定条件进行优化。先进行一级质谱分析(Q1扫描),得到3种待测物的准分子离子峰[M+H]⁺;然后对每种准分子离子峰进行二级质谱分析(子离子扫描),得到碎片离子信息,再对锥孔电压,碰撞能量等参数进行优化。遵循国际惯例,确证分析需要4个识别点^{[ 19 ]},要求选择2对分子离子对。 α -龙葵碱和 α -卡茄碱的子离子碎片较多,可以选择2对离子强度最高的分子离子对,而茄啶只有1个子离子碎片(m/z 98.1),故只能选用1对分子离子对。设定合适的峰驻留时间确保色谱峰的采样点数为15～20点,从而得到较好的定量重复性。

采用UPLC BEH C₁₈色谱柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μ m)对流动相条件进行优化,结果发现0.1%甲酸乙腈溶液和含0.05%甲酸的5 mmol/L 乙酸铵溶液作为流动相时,3种待测物的MRM响应最强,且峰形较好(见图2)。由于 α -龙葵碱和 α -卡茄碱具有相同的甙元,均含有3个单糖,分子结构非常相似,C₁₈柱无法分离。考虑到 α -龙葵碱和 α -卡茄碱的定量离子对都具有相同的子离子(m/z 98.2),可能会存在质谱通道间子离子的交叉干扰(cross-talk)。因此在本实验条件下单独进样 α -龙葵碱或 α -卡茄碱,结果均未检出 α -卡茄碱或 α -龙葵碱,说明 α -龙葵碱和 α -卡茄碱虽然在色谱上没有分离开,但并不相互干扰。

图2

Fig. 2

图2 空白血浆加标样品的MRM色谱图(10 ng/mL) Fig.2 MRM chromatograms of spiked blank plasma samples (10 ng/mL)

关于生物体液中的马铃薯生物碱测定的前处理,Hellenas等^{[ 15 ]}采用Bond Elut C2固相萃取柱处理血清样品,属反相机理,再经氰基柱液相色谱富集和纯化,操作烦琐，前处理周期长。 α -龙葵碱、 α -卡茄碱和茄啶为碱性化合物,适合用MCX固相萃取柱进行样品前处理。样品酸化后生物碱带正电,可以被MCX固相萃取柱保留,经2%甲酸水溶液和甲醇淋洗去除杂质,最终用含5%氨水的乙腈-甲醇溶液(6 ∶ 4)洗脱。与用20%甲醇水溶液配制成的标准溶液相比较,尿液中 α -龙葵碱、 α -卡茄碱和茄啶的基质效应分别为122% 、115%和124% ,提取回收率分别为92% 、95%和78% ;血浆中基质效应分别为121% 、120%和122% ,提取回收率分别为88% 、84%和76% 。由于缺少同位素内标,本方法采用基质加标外标法定量,可抵消基质增强效应,方法简单、快速。

在空白样品中,加入适量标准溶液制作系列(6点)基质加标溶液,进行样品前处理,然后在选定的色谱和质谱条件下进行测定,基质空白均无干扰。采用Masslynx 4.1中Targetlynx组件,以定量离子对的峰面积对基质加标质量浓度进行回归(权重取1/x),血浆和尿液中3种待测物在0.3～100 ng/mL 范围相关系数均为0.997～0.999,符合线性关系的要求。在空白样品中添加低浓度的系列标准溶液,进行样品前处理后上机测定。 α -龙葵碱和 α -卡茄碱以2对分子离子对3倍信噪比的响应值对应的样品质量浓度作为检出限(LOD),茄啶以定量分子离子对3倍信噪比的响应值对应的样品质量浓度作为检出限(LOD),以10倍信噪比作为定量限(LOQ)。结果表明血浆和尿液中3种待测物的检出限均为0.1 ng/mL,定量限均为0.3 ng/mL。目前马铃薯中毒时血和尿中生物碱的浓度未知,Hellenas等^{[ 15 ]}报道7名志愿者以0.4 mg α -龙葵碱/kg体重和0.6 mg α -卡茄碱/kg体重的剂量食用马铃薯。在食用5～6 h后,α -龙葵碱和 α -卡茄碱在血液中的浓度达到峰值,血清中平均峰质量浓度分别为7.7 ng/mL 和14.4 ng/mL;而在食后8～25 h内茄啶达到峰值(1.0～4.8 ng/mL)。以上质量浓度均在本法的线性范围内,因此本法能够满足检测的要求。

空白样品添加0.3、10和70 ng/mL 的3种待测物进行加标回收和精密度试验,结果见表2。血浆和尿液中的加标回收率分别为82% ～112%和96% ～114% ,相对标准偏差分别为4.0% ～16%和2.7% ～17%(n=6),符合痕量分析的要求。

分别用空白血浆和尿液加标,配制成含10 ng/mL 的3种待测物的质控样品进行3次冷冻和解冻循环(-20 ℃至室温),测定并与新制备的样品进行比较,结果的相对偏差的绝对值均小于10% 。含10 ng/mL 的3种待测物的血浆和尿液质控样品的处理液置于自动进样瓶中,在样品室中室温放置24 h后与新处理的样品进行比较,结果的相对偏差的绝对值均小于8% 。结果表明在上述条件下样品不会有明显的分解。