色谱  2014, Vol. 32 Issue (7): 702-706   PDF (1476KB)    
扩展功能
加入收藏夹
复制引文信息
加入引用管理器
Email Alert
RSS
本文作者相关文章
孙婷
王鹭骁
曾三妹
吴敏
严丽娟
张峰
黄志强
固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定猪肉中20种精神药物残留
孙婷1, 王鹭骁1, 曾三妹1, 吴敏1, 严丽娟1, 张峰2, 黄志强3     
1. 厦门出入境检验检疫局, 福建 厦门 361012;
2. 中国检验检疫科学研究院, 北京 100025;
3. 湖南出入境检验检疫局, 湖南 长沙 410004
收稿日期：2014-3-4
基金项目：国家科技支撑计划项目（2009BADB9B02，2012BAK08B01）；国家重大科学仪器设备开发专项项目（2012YQ14000806）.
通讯作者：严丽娟，E-mail：yanlj@xmciq.gov.cn；Tel:(0751)85627801；黄志强，E-mail：huangzq@hnciq.gov.cn.
摘要：建立了固相萃取和超高效液相色谱-电喷雾串联质谱（UPLC-ESI-MS/MS）同时测定猪肉中20种精神药物残留的方法。样品采用碱性乙腈作为提取试剂，提取液经Oasis MCX固相萃取柱净化后，以含0.1%（v/v）甲酸的水溶液和乙腈作为流动相梯度洗脱，用C18色谱柱分离，正离子模式扫描，多反应监测模式检测。20种化合物在5~100 μg/L质量浓度范围内均呈良好的线性关系，线性相关系数均大于0.99，以S/N≥10计算方法的定量限为5 μg/kg。在空白猪肉中添加5、10和50 μg/kg水平的20种药物，其平均回收率为66.8%~97.2%，相对标准偏差（RSD）为4.2%~12.4%。本方法快速、准确、可靠，适用于猪肉中精神药物多残留的同时测定。
关键词： 固相萃取     超高效液相色谱-电喷雾串联质谱     精神药物     猪肉    
Simultaneous determination of twenty psychoactive drugs in pork by solid phase extraction coupled with ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
SUN Ting1, WANG Luxiao1, ZENG Sanmei1, WU Min1, YAN Lijuan1 , ZHANG Feng2, HUANG Zhiqiang3     
1. Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Xiamen 361012, China;
2. Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100025, China;
3. Hunan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Changsha 410004, China
Received: 2014-3-4
Abstract: A method for the simultaneous determination of 20 psychoactive drugs in pork by solid phase extraction coupled with ultra performance liquid chromatography with electrospray ionization tandem mass spectrometry (UPLC-ESI-MS/MS) was established. The samples were extracted with alkalified acetonitrile, and then cleaned up using solid phase extraction with an Oasis MCX column. The UPLC separation was performed on a C18 column (50 mm×2.1 mm, 1.7 μm) using a gradient elution with the mobile phases of 0.1% (v/v) formic acid in water and acetonitrile. The ESI-MS/MS detection was achieved in positive mode under multiple reaction monitoring (MRM) mode. The calibration curves showed good linearity in the range of 5-100 μg/L with the correlation coefficients more than 0.99 for the 20 psychoactive drugs. The limits of quantification (LOQ, S/N≥10) for the 20 psychoactive drugs were 5 μg/kg. The average recoveries of the 20 psychoactive drugs spiked in blank pork at three levels of 5, 10 and 50 μg/kg were 66.8%-97.2% with the relative standard deviations from 4.2% to 12.4%. The method is suitable for the simultaneous determination of the 20 psychoactive drugs in pork with the characteristics of easy operation, high accuracy and precision.
Key words: solid phase extraction (SPE)     ultra performance liquid chromatography-electrospary ionization tandem mass spectrometry (UPLC-ESI-MS/MS)     psychoactive drugs     pork    

精神药物是指直接作用于中枢神经系统使之兴奋或抑制,连续使用可以产生依赖性的药品。按照药品的分子结构可分为吩噻嗪类、硫杂蒽类、丁酰苯类、苯甲酰胺类、二苯氧氮平类、苯二氮卓类等。精神药物能使动物平静,减轻机体对不良刺激的应激,防止应激引起的肉质变化,限制动物的运动,从而减少动物维持体能的营养物质消耗,有利于增重;将其作为动物生长促进剂使用,可提高动物生长速率。随着精神药物在兽医临床上的广泛应用,其对人体产生的间接毒副作用引起了人们的广泛关注。由于该类药物对人体中枢神经系统会造成不良影响,因此许多国家将此类药物列入禁用药物。我国农业部235号公告已明确规定了安眠酮禁止使用,氯丙嗪和地西泮只允许用作治疗,这几种精神药物在动物源性食品中均不得检出。

目前,精神药物的检测方法有酶联免疫法(ELISA)[1,2,3]、气相色谱法(GC)[4,5,6]、高效液相色谱法(HPLC)[7,8,9]、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[10,11]和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[12,13,14,15,16,17,18,19,20]等。大部分精神药物的极性较大,其代谢产物的极性更大,采用GC进行分析时,需先进行衍生化,耗时较长。GC-MS采用全扫描方式,灵敏度较低,需要进行富集、净化等样品前处理,方法繁琐费时。HPLC-紫外检测法灵敏度较低,定性能力差。LC-MS/MS可提供待测物的结构信息,具有较高的灵敏度,选择性和特异性较好,是同时检测多种精神药物的理想方法。郭德华等[14]建立了动物源性食品中19种苯二氮卓类药物的检测方法。张秀尧等[15]建立了血浆和尿液中42种精神药物及其代谢产物的快速确证分析方法。许成保等[16]建立了动物饲料中10种违禁精神药物的检测方法。国内外文献报道的关于精神药物的检测多集中在药学领域,基质以尿液、血样为主,以复杂食品基质为对象的分析研究还比较少。本研究采用固相萃取和超高效液相色谱-电喷雾串联质谱(UPLC-ESI-MS/MS),建立了同时测定猪肉中20种精神药物的方法,探索了猪肉中痕量精神药物残留的选择性萃取机理。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

Waters Acquity UPLC-TQD超高效液相色谱-串联四极杆质谱联用仪(美国Waters公司),配有电喷雾离子源(ESI);Allegra 64R型高速冷冻离心机(美国Beckman Coulter公司); 12通道半自动固相萃取装置(美国Supelco公司); T25型高速分散机、旋涡混合器(德国IKA公司);全自动氮吹浓缩仪(美国Capiler Life Sciences公司); Waters Oasis MCX固相萃取小柱(3 mL/60 mg,美国Waters公司)。Rigol L-3000高效液相色谱仪(北京普源精电科技有限公司,用于前期色谱条件优化实验)。

20种精神药物标准品均购自美国Cerilliant公司,纯度均大于98% 。甲醇、乙腈、异丙醇、乙酸乙酯均为色谱纯,购自德国Merck公司;甲酸为色谱纯,购自Fluka公司;其他试剂为分析纯。实验用水由Milli-Q系统(美国Millipore公司)制得。

准确称取各标准品适量,分别用甲醇溶解并定容,配成1.0 g/L 的单标准储备液,于-18 ℃下避光保存。移取各单标准储备液,用甲醇稀释成10.0 mg/L 的混合标准中间溶液,于-18 ℃下避光保存。根据需要用50%(v/v)甲醇水溶液逐级稀释配成适当浓度的混合标准工作液,现用现配。

1.2 样品前处理

称取2 g(精确至0.01 g)猪肉样品于50 mL具塞离心管中,加入10 mL乙腈和0.2 mL 4 mol/L 碳酸钾溶液,充分混合并均质,于 4 000 r/min 下离心5 min,收集上清液;再加入10 mL乙腈和0.2 mL 4 mol/L 碳酸钾溶液重复提取1次;合并上清液,于40 ℃下氮气吹至近干。加入3 mL 0.1 mol/L 盐酸溶液溶解,待净化。

预先依次用3 mL甲醇、3 mL水和3 mL 0.1 mol/L 盐酸溶液活化Oasis MCX固相萃取柱。将上述提取液全部过柱,弃去流出液;依次以3 mL水和3 mL甲醇淋洗,弃去全部淋出液,抽干萃取柱;最后用5 mL 4%氨水甲醇溶液洗脱,收集洗脱液,于40 ℃下氮气吹干,用50%甲醇水溶液定容至1 mL,经0.22 μ m尼龙滤膜过滤后,供UPLC-ESI-MS/MS测定。

1.3 UPLC-ESI-MS/MS条件

色谱柱:Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μ m);柱温:35 ℃;流速:0.3 mL/min;进样体积:2 μ L;流动相:0.1%(v/v)甲酸水溶液(A)和乙腈(B);梯度洗脱程序:0～5.00 min,B相由10%线性增加至60% ;5.01 min时B相升至90%并保持至7.50 min；7.51 min时B相降至10%并保持至10.00 min。

电喷雾电离源,正离子扫描多反应监测(MRM)模式;采用2个通道进行数据采集,其中通道1采集时间为0～4.1 min;通道2采集时间为3.9～6.0 min。毛细管电压:3.0 kV;离子源温度:110 ℃;雾化气温度:350 ℃;雾化气流速:800 L/h;反吹气流速:50 L/h;滞留时间:25 ms;监测离子对、锥孔电压和碰撞能量等参数见表1。

表1 20种精神药物的ESI-MS/MS参数 Table 1 ESI-MS/MS parameters of the 20 psychoactive drugs
2 结果与讨论
2.1 质谱条件的优化

采用针泵连续进样,在正离子模式下,分别对质量浓度为1 mg/L 的单标准溶液进行母离子全扫描,确定分子离子,并优化各分子离子的锥孔电压。然后分别以上述分子离子为母离子,对其子离子进行全扫描,选择丰度较高、干扰较小的两对子离子为定性离子对,将丰度最高的子离子作为定量离子对,并优化其碰撞能量。优化后的质谱参数见表1。在优化后的液相色谱分离条件下,根据各种化合物的保留时间,设置了2个采集通道,每个通道分别监测10种化合物,通道1采集时间为0～4.1 min,通道2采集时间为3.9～6.0 min。

图1显示了在优化的分离条件下,质量浓度为10 μ g/L 的混合标准溶液的两通道叠加总离子流色谱图。各药物定量离子对的MRM色谱图见图2。

图1 20种精神药物混合标准溶液的两通道叠加总离子流色谱图 Fig.1 Total ion chromatogram of a mixed standard solution of the 20 psychoactive drugs by overlapping two channels

图220种精神药物标准品定量离子对的MRM色谱图 Fig.2 MRM chromatograms of the 20 psychoactive drug standards
2.2 提取条件的优化

目前,对动物组织中精神药物残留分析的前处理方法主要有两种:一种是通过有机溶剂直接提取,然后再通过液液分配或冷冻离心去除脂肪进行前处理;另一种是通过有机溶剂提取,再通过固相萃取净化。本实验采用第二种方法进行样品前处理。

本实验中比较了乙腈、乙腈+碱、乙酸乙酯、乙酸乙酯+碱、乙酸乙酯-异丙醇(5 ∶ 1,v/v)等5种不同提取溶剂对猪肉中20种精神药物的提取效率,碱的加入量为0.2 mL 4 mol/L 碳酸钾溶液。由于这20种精神药物均具有环状结构,熔点、沸点较高,其基本结构中均含有氮原子,呈中性或弱碱性。将提取溶剂的pH调至碱性,可抑制碱性药物的电离,提高有机溶剂的萃取效率。当以乙腈或乙酸乙酯作为提取溶剂时,加入碳酸钾溶液调节pH至10以上时可显著提高猪肉中精神药物的回收率。此外,实验发现,在乙酸乙酯中加入一定比例的异丙醇调节提取溶剂的极性,对部分含有羟基和氨基的精神药物的提取效率明显提高。但是由于猪肉中脂肪含量较高,以乙酸乙酯或者乙酸乙酯-异丙醇为提取溶剂时,提取液中的油脂较多,在后续固相萃取过程中易造成堵柱或出现过柱速度慢的现象,从而影响前处理的效率和重现性。综合而言,采用碱性乙腈作为提取溶剂的效果最好,能获得较满意的回收率。

2.3 固相萃取条件的优化

MCX固相萃取柱的填料是一种混合型强阳离子交换、水可浸润性聚合物吸附剂,对于碱性化合物具有良好的净化效果。通常需调节上样溶液为酸性条件,使碱性化合物保持阳离子形态,与萃取柱的磺酸基发生相互作用从而被吸附,然后依次用水、甲醇淋洗除去弱酸性和中性化合物,再用氨化甲醇溶液调节pH值为碱性,此时目标化合物呈中性从而被甲醇洗脱下来。通过MCX固相萃取净化过程,能够有效去除基质干扰,提高检测灵敏度和准确性。

对于猪肉等含油脂较多的样品,MCX固相萃取柱可选择性地萃取阳离子型化合物,方便去除脂肪等杂质。为了使碱性药物呈离子形态使其在MCX固相萃取柱上获得更好的保留,通常上样溶液需要调至酸性。实验比较了上样溶液pH分别为1和4的条件下对20种精神药物回收率的影响。当上样溶液为弱酸性(pH=4)时,奥沙西泮、替马西泮、阿普唑仑、艾司唑仑和氟硝西泮的回收率仅为30%左右,可能是因为这些化合物均为弱碱性,其pKa在1.5～3之间,需要调节溶液pH至1左右才能使之解离,获得较好的保留效果。调节上样溶液pH=1时,20种精神药物均获得满意的回收率,且能去除脂肪等杂质,有效降低基质效应的影响。

2.4 方法的线性范围和检出限

取质量浓度分别为5、10、20、50和100 μ g/L 的系列混合标准溶液进行测定,以各药物定量离子对的峰面积A和对应的质量浓度C( μ g/L)绘制标准曲线。在5～100 μ g/L质量浓度范围内,20种药物呈良好的线性关系,相关系数均大于0.99。按照色谱峰面积S/N≥10计算20种精神药物的定量限均为5 μ g/kg。

2.5 回收率和精密度

在空白冻猪肉样品中添加5、10和50 μ g/kg 标准品后进行回收试验,每个水平测定6次,各加标水平的回收率和精密度见表2。20种药物在冻猪肉中的平均加标回收率在66.8% ～97.2%之间,相对标准偏差(RSD)在4.2% ～12.4%之间。

表2 空白猪肉中20种精神药物的平均加标回收率及精密度(n=6) Table 2 Recoveries and precisions of the 20 psychoactive drugs spiked in blank pork (n=6)
3 结论

本文建立了固相萃取和超高效液相色谱-电喷雾串联质谱同时测定猪肉中20种精神药物的检测方法。该方法具有快速简便、专属性强、定性准确等优点,各项技术指标均能满足日常检测分析要求,适用于动物源性食品中精神药物残留的检测和确证。

参考文献
[1]Cooper J, Delahaut P, Fodey T L, et al. Analyst, 2004, 129(2): 169  
[2]Fischer W J, Garthwaite I, Miles C O, et al. Environ Sci Technol, 2001, 35(24): 4849  
[3]Wang Y Y, Jia T. Feed Research (王有月, 贾陶. 饲料研究), 2008(11): 50
[4]Borges K B, Urias T S, Freire E F, et al. Anal Lett, 2011, 44(18): 2922  
[5]Krogh M, Grefslie H, Rasmussen K E. J Chromatogr B, 1997, 689(2): 357  
[6]Yao L J, Tan J Y, Jiang Z L, et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry (姚丽娟, 谭家镒, 姜兆林, 等. 分析化学), 2004, 32(1): 9
[7]Armagan O. Eur J Med Chem, 2009, 44(12): 4998  
[8]Mercolini L, Mandrioli R, Iannello C, et al. Talanta, 2009, 80(1): 279  
[9]Borrey D, Meyer E, Lambert W, et al. J Chromatogr B, 2001, 765(2): 187  
[10]Wu H Q, Jin Y C, Cai M Z, et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry (吴惠勤, 金永春, 蔡明招, 等. 分析化学), 2007, 35(4): 500
[11]Zhu X L, Liu Q, Li D, et al. Chinese Journal of Veterinary Medicine (朱馨乐, 刘琪, 李丹, 等. 中国兽医杂志), 2009, 43(1): 28
[12]Irving R C, Dickson S J. Forensic Sci Int, 2007, 166(1): 58  
[13]Lamber K S. Biomed Chromatogr, 2012, 26(1): 1
[14]Guo D H, Deng X J, Zhao S Z, et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry (郭德华, 邓晓军, 赵善贞, 等. 分析化学), 2010, 38(3): 318
[15]Zhang X Y, Cai X X, Zhang X Y, et al. Chinese Journal of Chromatography (张秀尧, 蔡欣欣, 张晓艺, 等. 色谱), 2010, 28(1): 23  
[16]Xu C B, Suo R, Zhang F, et al. Chinese Journal of Chromatography (许成保, 锁然, 张峰, 等. 色谱), 2012, 30(5): 457
[17]Kim T, London A, Kharasch E D. J Pharm Biomed Anal, 2011, 55(3): 487  
[18]Pan R N, Hsiong C H, Huang P W, et al. J Anal Toxicol, 2011, 35(3): 170  
[19]Wohlfarth A, Toepfner N, Hermanns-Clausen M, et al. Anal Bioanal Chem, 2011, 400(3): 737  
[20]Kiss B, Bogdan C, Pop A, et al. Talanta, 2012, 99: 649