色谱  2014, Vol. 32 Issue (7): 717-722   PDF (1053KB)    
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巩佳第
曹晓林
曹赵云
卞英芳
于莎莎
陈铭学
液相色谱-电感耦合等离子体质谱法测定稻米中的5种砷形态
巩佳第, 曹晓林, 曹赵云, 卞英芳, 于莎莎, 陈铭学     
中国水稻研究所 农业部稻米及制品质量监督检验测试中心, 浙江 杭州 310006
收稿日期：2014-3-12
基金项目：浙江省重点科技创新团队项目（2012R10028-05）.
通讯作者：陈铭学，E-mail：cmingxue@163.com.
摘要：建立了稻米中砷酸根[As（Ⅴ）]、亚砷酸根[As（Ⅲ）]、砷甜菜碱（AsB）、一甲基砷（MMA）和二甲基砷（DMA）的液相色谱-电感耦合等离子体质谱（LC-ICP-MS）检测方法。以0.3 mol/L硝酸水溶液为提取试剂，样品在石墨消解仪中于95 ℃消解1.5 h，上清液供LC-ICP-MS分析。5种砷形态采用Dionex IonPac AS19阴离子交换柱（250 mm×4 mm）分离，经ICP-MS检测。比较了4种提取液对稻米中5种砷形态的提取效率，并对提取溶剂的浓度、提取温度和提取时间等条件进行了优化。通过加标回收试验结合测定标准物质考察了方法准确度及精密度，在2个加标水平上各形态的回收率为89.6%~99.5%，RSD（n=5）不大于3.6%，大米标准物质中各形态之和的测定结果与其标准值吻合，5种砷形态的线性范围AsB和DMA为0.05~200 μg/L，As（Ⅲ）和MMA为0.10~400 μg/L，As（V）为0.15~600 μg/L，方法检出限为0.15~0.45 μg/kg。结果表明，本方法简单、灵敏、耐用，可用于稻米中5种砷形态的准确定量和风险评估。
关键词： 石墨消解     液相色谱     电感耦合等离子体质谱     砷形态     稻米     硝酸    
Determination of five arsenic species in rice by liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry
GONG Jiadi, CAO Xiaolin, CAO Zhaoyun, BIAN Yingfang, YU Shasha, CHEN Mingxue     
China National Rice Research Institute, Rice Product Quality Inspection and Supervision Center of Ministry of Agriculture, Hangzhou 310006, China
Received: 2014-3-12
Abstract: A method was developed for the simultaneous determination of arsenic acid [As (Ⅴ)], arsenious acid [As (Ⅲ)], arsenobetaine (AsB), monomethylarsonic acid (MMA) and dimethylarsinic acid (DMA) in rice by liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry (LC-ICP-MS). The extraction reagent was 0.3 mol/L nitric acid with heat-assistant condition for 1.5 h at 95 ℃. Then, the five arsenic species were separated by an anion exchange column (Dionex IonPac AS19, 250 mm×4 mm) and detected by ICP-MS. Four kinds of extracted solutions were compared through the extraction efficiency. The concentration of nitric acid, the temperature and the extraction time were optimized. The recoveries of the five arsenic species spiked in rice at two levels ranged from 89.6% to 99.5% with the relative standard deviations (RSDs, n=5) of 0.6%-3.6%. The measured values of the arsenic species in standard rice materials were consistent with their standard values. The linear ranges were 0.05-200 μg/L for AsB and DMA, 0.10-400 μg/L for As (Ⅲ) and MMA, 0.15-600 μg/L for As (V). The limits of detection for the five arsenic species were 0.15-0.45 μg/kg. The results showed that the method is much more precise for the risk assessment of the rice. This method is simple, accurate and durable for the determination of arsenic species in rice.
Key words: graphite digestion     liquid chromatography (LC)     inductively coupled plasma-mass spectrometry (ICP-MS)     arsenic species     rice     nitric acid    

水稻是除饮用水以外,人体对砷摄入的最主要来源[1]。大量研究表明,稻米中砷主要以无机态的砷酸盐、亚砷酸盐,以及有机态的二甲基砷(DMA)、一甲基砷(MMA)和少量的砷甜菜碱(AsB)等形式存在[2,3,4]。由于无机砷的毒性高于有机砷,目前国内外仅对稻米中的无机砷限量做出规定,但研究表明,有些有机砷可能与癌细胞活性有关,也存在毒性[5,6,7]。因此,对稻米中各种砷形态进行全面的分析才能科学、客观地对稻米砷安全做出评价,并开展相关的风险评估工作。

在稻米砷形态分析中,如何实现对各形态完全提取,同时又要避免形态间的相互转化,是其主要的技术难点[8,9]。研究认为稻米基质中的巯基化合物(如谷胱甘肽、半胱氨酸等)在低氧化还原环境中,可将砷酸根[As(V)]部分还原为亚砷酸根[As(Ⅲ)],而使得As(Ⅴ)测定结果偏低;若采用过强的氧化体系提取,则导致As(Ⅲ)的响应降低,甚至不能被测定[10,11,12]。目前,基于酸体系结合热辅助提取技术被认为是解决上述问题的有效途径,如近几年报道的硝酸热辅助提取法、甲醇-HNO3热超声浸提法、三氟乙酸微波萃取法等[13,14,15]。但这些技术的提取效率存在明显的差异,且酸介质对后续的色谱分离非常不利,如极易引起常规离子交换柱的柱效下降及柱压上升等。此外,在加热方式上,与本文采用的石墨消解仪相比,微波消解存在分析效率较低、分析成本较高的问题,而电热板的控温能力相对较弱。由此可见,针对稻米中5种砷形态的提取、分离方法,还有待于进一步完善和统一。

本工作采用石墨消解法提取,以耐酸较强的Dionex IonPac AS19阴离子交换柱为色谱分离材料,在对几种常用的砷形态提取方法[13, 14, 16, 17]进行比较的基础上,对提取试剂的浓度、提取时间和提取温度等条件进行了优化,结合ICP-MS高灵敏度检测,成功地建立了稻米中5种砷形态的检测方法,方法简单、准确、耐用。

1 实验部分
1.1 仪器

1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司)、X-series 2电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS,美国ThermoFisher公司)、PM400电子天平(瑞士METTLER公司)、PHS-3C精密pH计(上海雷磁仪器公司)、MS3 basic漩涡振荡仪(德国IKA公司)、Cyclotec 1093旋风研磨仪(丹麦Foss公司)、KQ-800TED型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、Primo R离心机(美国ThermoFisher公司)、DigiBlock ED-54石墨消解仪(莱伯泰科公司),Oasis MAX小柱(3 mL/60 mg,美国Waters公司)。

1.2 试剂与材料

磷酸二氢钠、无水乙酸钠、乙二胺四乙酸二钠(分析纯,Fluka),硝酸钾(分析纯,Aldrich),氢氧化钠(分析纯,ACROS),乙醇(色谱纯,Merck),三氟乙酸(TFA,纯度≥95.0% ,ACS),硝酸(68% ～70% ,上海安谱科学仪器有限公司),甲醇(色谱纯,Merck);实验室用水为Milli-Q高纯水。

砷标准溶液:As(V)(GBW08667)、As(Ⅲ) (GBW08666)、AsB(GBW08670)、MMA(GBW08668)、DMA(GBW08669)以及砷单标准储备液(1 000 mg/L)均购于国家标准物质中心。5种砷形态混合标准储备液:用纯水将5种砷形态稀释成质量浓度均为2 mg/L(以As计)的混合标准储备液,置于4 ℃冰箱中避光保存。砷标准工作液和混合标准工作液现用现配。

实验室稻米样品随机采购于当地农贸市场。

1.3 砷形态分析
1.3.1 样品预处理

取待测稻米样品于旋风研磨仪中粉碎,过80目筛,准确称取样品1.000 g,置于50 mL聚丙烯离心管中,加入10 mL 0.3 mol/L 硝酸水溶液,涡旋混匀,再置于石墨消解仪中在95 ℃下提取90 min。 将提取液冷却至室温,在8 000 r/min 下离心15 min,上清液过0.22 μ m滤膜后,供LC-ICP-MS分析。

1.3.2 仪器条件

液相色谱条件中的流动相参考国家标准[18];流速0.9 mL/min;进样体积20 μ L。阴离子保护柱IonPac AG19(50 mm×4 mm,Dionex);阴离子分析柱IonPac AS19(250 mm×4 mm,Dionex)。

ICP-MS工作参数:功率 1 224 W,辅助气流量0.8 L/min,冷却气流量12 L/min,雾化气流速0.95 L/min,采集质量数砷75,载气(氩气)纯度≥99.999% 。

1.4 总砷含量的测定

总砷含量测定参照国家标准[19]。随机选取了一个稻米样品,按该方法测定,其结果为235.7 μ g/kg(n=5),用于下文中对提取方法的优化研究。

2 结果与讨论
2.1 提取试剂的选择

目前针对砷形态的提取溶剂主要有有机试剂、无机试剂以及复合试剂,另外还有酶试剂提取等[15, 20, 21, 22]。比较了50%(v/v)甲醇水溶液(含1%(v/v)硝酸水溶液)、0.3 mol/L 硝酸水溶液、3%(v/v)三氟乙酸(TFA)水溶液和水4种提取试剂对5种砷形态的提取效率。其中,甲醇提取法于55 ℃下超声30 min,提取液在6 000 r/min 下离心15 min,上清液过MAX柱后上机分析;0.3 mol/L 硝酸水溶液提取按1.3节样品预处理方法进行;3%三氟乙酸提取法于80 ℃下浸提2 h;水提取法于90 ℃下浸提3 h,三氟乙酸水溶液和水提取法所得提取液都以 8 000 r/min 离心15 min,上清液过0.22 μ m滤膜后上机分析。上述4种提取剂对5种砷形态的提取效果见图1。

图1 4种提取试剂对5种砷形态的提取量(n=3) Fig. 1 Extraction amounts of the five arsenic species with the four extraction reagents (n=3)

由图1可以看出,以0.3 mol/L 硝酸水溶液对总砷(这里指各形态之和)的提取量最多(232.5 μ g/kg),其提取效率达98.6% ;水和TFA其次,对应的提取效率分别为93.8%和88.9% ;而50%甲醇最低,提取效率仅为49.2% 。其次,从各砷形态的提取量来看,总体上仍以0.3 mol/L 硝酸水溶液效果最好,其中As(Ⅴ)、MMA、DMA、As(Ⅲ)和AsB的提取量分别为35.1、6.9、58.1、130.9、1.5 μ g/kg,而TFA和甲醇试剂几乎不能将MMA提取出来。此外,纯水的总体提取效果虽仅次于0.3 mol/L 硝酸水溶液,但对As(Ⅴ)和DMA的提取效果较差,其提取量仅为0.3 mol/L 硝酸水溶液的86.3%和81.1% 。综合考虑,以0.3 mol/L 硝酸水溶液对稻米中砷形态的提取效果最好。

2.2 提取条件的优化
2.2.1 硝酸浓度对5种砷形态提取效率的影响

将提取温度和提取时间设为95 ℃和90 min,分别考察了0、0.15、0.3和0.45 mol/L 硝酸水溶液对各形态砷的提取效率及形态转化的影响,提取过程按1.3.1节样品预处理方法进行,结果见图2。

图2 不同硝酸浓度下5种砷形态的提取量(n=3) Fig. 2 Extraction amounts of different concentrations of nitric acid on the five arsenic species (n=3)

由图2可以看出,当试样采用不同浓度的硝酸提取时,其对As(Ⅲ)和AsB的提取量影响不明显,而DMA、As(V)和MMA的提取量总体上均随着硝酸浓度的增加而提高,且当硝酸浓度为0.3 mol/L 时,这3种砷形态的提取量基本均达到最大,同时,总砷提取效率也达到最高(100.2% )。

从硝酸对As(V)和As(Ⅲ)的转化影响来看,只有当硝酸浓度≥0.15 mol/L 时,稻米基质中还原性物质才能得到完全抑制,相应地As(V)提取量则有了明显的上升,之后便保持稳定。对于As(Ⅲ)而言,与不含硝酸的提取液相比,其在0.15 mol/L 的硝酸水溶液中仅下降4% ,基本不影响测定;而当硝酸浓度再增大时,则几乎不发生变化。综合考虑,选择0.3 mol/L 为最佳硝酸浓度。

2.2.2 提取温度的选择

以0.3 mol/L 硝酸水溶液为提取剂,提取时间设为90 min，考察了不同温度(65、75、85、95、105 ℃)对5种砷形态的提取效率的影响，结果见图3。

图3表明,随着提取温度的升高,除AsB和DMA的提取效率无明显变化外,其余3种形态砷的提取效率总体呈上升趋势。当温度提高至95 ℃时,5种砷形态的提取量基本均达到最大,与65 ℃时相比,As(Ⅲ)、As(V)和MMA的提取量分别上升了24.4% 、38.8%和73.9% ,且总砷提取效率也达到最高(100.8% )。从各形态变化趋势看,As(Ⅲ)在85 ℃时提取量就有明显的提升且之后便趋于稳定。而对于As(V)和MMA,只有温度提高至95 ℃时,其提取量才有明显的上升,之后保持稳定。因此,选择最佳提取温度为95 ℃。

图3 不同温度下5种砷形态的提取量(n=3) Fig. 3 Extraction amounts at different temperatures of the five arsenic species (n=3)

此外,还考察了提取时间对5种砷形态提取效率的影响。提取时间在30～180 min内,每隔30 min进行测定。结果发现,除提取时间少于60 min时的提取率低以外,其余时间点对稻米中各形态砷的提取效率无明显差异。为取得较好的提取效率和稳定的结果,选择提取时间为90 min。

2.3 对5种砷形态转化的考察

为进一步考察样品提取过程中砷形态是否发生转化,对空白稻米(仅As(Ⅲ)有检出,含量为1.93 μ g/kg)分别进行100 μ g/kg 的单一形态加标试验(n=3)。按照1.3.1节的步骤进行处理，结果表明,稻米中添加As(V)后,对应的检出值为93.66 μ g/kg,回收率为93.7% ,并没有As(Ⅲ)及其他形态检出。同样,对As(Ⅲ)、AsB、MMA和DMA的添加试验表明,其回收率为92.5% ～98.5% ,也未发现有砷形态之间相互转化的现象。以上研究结果与Huang等[9]以及Zhang等[23]的结果相似。因此,采用0.3 mol/L 的硝酸于95 ℃下消解1.5 h,可避免稻米中5种砷形态的相互转化。

2.4 线性范围和检出限

将5种砷形态的混合标准溶液分别配制成含AsB和DMA 0.05、0.5、5、50、200 μ g/L,As(Ⅲ)和MMA 0.1、1、10、100、400 μ g/L,As(V) 0.15、1.5、15、150、600 μ g/L 的混合溶液。在最佳的仪器条件下进样测定,测定结果以各形态的质量浓度为横坐标(x,μ g/L),峰面积为纵坐标(y)绘制标准曲线,得到的线性方程和相关系数见表1。结果表明,目标分析物在相应的质量浓度范围内具有较好的线性关系,各分析物标准曲线的相关系数不低于 0.999 9。

取5种砷形态的混合标准溶液,按确定的方法测定,以不低于3倍信噪比(S/N≥3)确定方法的检出限(LOD),以S/N≥10确定方法的定量限(LOQ)。结果如表1所示,5种砷形态的LOD为0.15～0.45 μ g/kg,LOQ为0.50～1.50 μ g/kg。

表1 5种砷形态的线性范围、线性方程、相关系数(r)、 检出限(LOD)与定量限(LOQ) Table 1 Linear ranges,linear equations,correlation coefficients (r),limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) of the five arsenic species
2.5 方法的准确度和精密度

本工作分别通过国家大米标准物质(GBW10010)结合加标回收方式考察方法准确度和精密度。由表2可看出,本方法对大米标准物质中各形态之和(Sum)的测定结果为99.15 μ g/kg,与其标准值(102±8) μ g/kg 基本一致。

表2 GBW10010中5种砷形态含量和相对标准偏差(n=5) Table 2 Contents and RSDs of the five arsenic species in GBW10010 (n=5)

本工作在粉碎的大米中加入5、50 μ g/kg 的AsB和DMA,10、100 μ g/kg 的As(Ⅲ)和MMA,15、150 μ g/kg 的As(V),按照1.3.1节的步骤进行处理,分别测定5种砷形态的回收率及其精密度，结果见表3。结果表明,在2个加标水平上,各形态的回收率为89.6% ～99.5% ,RSD为0.6% ～3.6% 。两种验证结果表明,该方法回收率高,结果稳定可靠。

2.6 实际样品测定

利用建立的方法对市场上15份稻米样品进行了测定(n=3),结果如表4所示:15份样品中无机砷(iAs,As(Ⅲ)与As(V)之和)的含量均低于限量值(200 μ g/kg),全部符合我国食品卫生标准[5]。从各形态的检测结果看,稻米中砷主要以As(Ⅲ)形式存在,对应的含量为35.96～150.83 μ g/kg；其次为DMA和As(V),对应的含量分别为5.24～98.13 μ g/kg 和4.18～13.63 μ g/kg；仅13号样品中检出少量的AsB,其含量为0.61 μ g/kg。

表 3 大米基质中5种砷形态的加标回收率和相对标准偏差(n=5) Table 3 Recoveries and RSDs of the five arsenic species spiked in rice (n=5)
表 4 稻米样品中5种砷形态的测定结果(n=3) Table 4 Results of the five arsenic species in rice samples (n=3) μ g/kg

5种砷形态混合标准溶液(10 μ g/L )的色谱图见图4,两个大米实际样品(15号和13号)的色谱图见图5。从这些色谱图中可以看出,采用所建立的样品预处理方法及仪器条件,5种砷形态均得到基线分离,且峰形良好、灵敏度较高,说明该方法能满足稻米中砷形态分析的要求。

图4 5种砷形态的混合标准溶液的LC-ICP-MS色谱图 Fig.4 LC-ICP-MS chromatogram of the mixture of the five standards of arsenic species Mass concentration of each standard: 10 μ g/L.
图5 15号和13号大米样品中5种砷形态的LC-ICP-MS色谱图 Fig.5 LC-ICP-MS chromatograms of the five arsenic species in rice samples No. 15 and No. 13
3 结论

以0.3 mol/L 硝酸水溶液为提取剂,基于石墨消解仪控温提取，解决了目前对稻米中5种砷形态提取效率低、各形态间易转化的难题。结果表明,该提取方法回收率高、操作简单,尤其适合于高通量分析。此外,本研究采用Dionex IonPac AS19阴离子交换柱对5种砷形态进行分离和ICP-MS检测,极大地提高了方法的耐用性和分析灵敏度。由此可见,本方法适合于稻米中5种砷形态的准确定性、定量分析。

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