表观遗传学研究基因表达在核苷酸序列不发生改变的情况下进行的可遗传性变化。DNA甲基化是研究最为广泛的表观遗传修饰,胞嘧啶在甲基转移酶的作用下形成5-甲基胞嘧啶(5-methylcytidine,5mC)。异常的DNA甲基化会导致染色质构象改变,最终抑制基因转录,改变基因表达量和活性;同时,还会影响细胞的增殖和分化,并与癌症的诱发有着密切的联系[1,2,3,4]。继胞嘧啶的5-甲基修饰形式之后,被称为第6个碱基的5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5hmC)作为又一重要的表观遗传修饰受到广泛关注。甲基胞嘧啶双加氧酶(ten-eleven translocation,tet)可将羟基转移到5mC上形成5hmC。5hmC被认为是DNA去甲基化过程中的关键中间产物,羟甲基化DNA具有参与基因表达调控的潜在功能,同时5hmC可以通过多种途径重新转化成未修饰胞嘧啶,修复异常的DNA甲基化[5,6]。准确测定全基因组DNA甲基化和羟甲基化水平对于研究疾病机理和环境污染物健康效应具有重要的作用。
全基因组整体甲基化水平的分析方法主要包括SssI甲基转移酶法、氯乙醛法、免疫化学法和高效液相色谱及相关方法。作为最早发展的方法,SssI甲基转移酶法由于酶不稳定导致结果不够精确[7]。氯乙醛反应法具有较高的灵敏度和稳定性,但是操作费时费力,而且氯乙醛为有毒物质[8]。免疫化学法可以对DNA甲基化和羟甲基化水平进行测定,但是由于使用特异性抗体,检测成本较高。近年来,高效液相色谱成为基因组整体水平DNA甲基化水平的主流检测方法[9]。但是受紫外检测器本身灵敏度的限制,该法对于DNA含量较低的生物样品的分析不够理想。除此以外,高效毛细管电泳法、单分子实时测序方法和酶区甲基化分析方法也被应用于全基因组DNA甲基化和羟甲基化水平的检测[9,10,11,12]。最近的研究发现生物体内5hmC的含量非常低[13],而且存在多种不同基团修饰的胞嘧啶[5],酶学方法和亚硫酸盐处理等技术不能区分不同基团修饰的胞嘧啶,亟待发展可以同时高效、准确测定5mC和5hmC的检测方法。我们最近采用串联质谱作为检测器,测定了细胞系和血浆、精子样本的全基因组DNA甲基化率[14]。本研究在以前的基础上改进了液相色谱-串联质谱法，可同时定量测定5mC和5hmC,并应用于研究砷暴露大鼠全基因组DNA甲基化和羟甲基化水平。该方法快速简便且重现性好,具有较高的灵敏度和准确度,能够满足生物样品中5mC和5hmC定量分析要求。
UltimateTM LC-液相色谱(Dionex,美国); 5500 QTRAP串联质谱(ABI,美国);凝胶成像系统(Bio-RAD,美国); kinetex® core-shell C18柱(Phenomenex,美国);恒温水浴锅(上海梅香仪器,中国);台式高速冷冻离心机(Hettich,德国); ND-1000超微量紫外分光光度计(NanoDrop,美国); 80 ℃超低温冰箱(海尔,中国); Milli-Q超纯水处理系统(Pall,美国);微量移液器(10、20、100、200、1000、5000 μ L)(Eppendorf,德国)。亚砷酸钠(NaAsO2,分析纯,国家标准物质中心,中国); DNA提取试剂盒(DNeasy Blood & Tissue Kit，QIAGEN,德国); RNase A (天根生化,中国); DNaseⅠ(RNase-free)、FastAPTM Thermosensitive Alkaline Phosphatase、Exonuclease Ⅰ(Fermentas,加拿大); 5-甲基脱氧胞嘧啶核苷(2′-deoxy-5-methylcytidine,5mdC,东京仁成工业株式会社,日本);脱氧鸟嘌呤核苷(deoxyguanosine,dG,百灵威,中国); 5-甲基脱氧胞嘧啶DNA标准品(5-Methylcytosine & 5-Hydroxymethylcytosine DNA Standard,Zymo Research,美国);甲醇(色谱纯,Honeywell,美国)。
SPF级健康Sprague Dawley雄性大鼠30只(购自上海斯莱克实验动物有限公司),体重为(200±10) g。适应性饲养1周后,大鼠随机分组编号:对照组为6只,暴露组为8只。暴露组饮水中亚砷酸钠的质量浓度分别为2 mg/L。动物每日经自然饮水连续暴露染毒,持续9周。大鼠每日给予充足饮水和食物,并记录每日饮水消耗量,每7天测量1次体重。9周后进行取材。使大鼠吸入乙醚麻醉,仰卧固定于操作台,对其进行解剖,取其肝脏和小脑,至于-80 ℃保存待用。
取保存于-80 ℃的肝脏和小脑样品,置于-20 ℃半小时,而后于4 ℃对样品进行退冻。称取适量的样品,采用DNA提取试剂盒提取DNA,流程严格按照试剂盒说明书进行。为避免RNA干扰实验结果,在提取过程中加入RNase A,并在提取后用1%琼脂糖凝胶电泳检验提取结果。利用超微量紫外分光光度计测定提取的DNA浓度。DNA的酶解参照文献[14,15]报道的方法。根据测得的DNA浓度,取1 μ g DNA样品于100 ℃水浴中加热3 min,然后冰浴10 min,加入1/10体积的0.1 mol/L 醋酸铵溶液(pH 7.5);加入2 units DNase Ⅰ,于37 ℃水浴中孵育3 h;然后加入2 units Alkaline Phosphatase,于37 ℃水浴中孵育3 h;最后加入40 units Exonuclease Ⅰ,于37 ℃水浴中孵育过夜保证DNA酶解完全。酶解后用1%琼脂糖凝胶电泳检验酶解效果。
分别精确称取1 mg 5mdC和dG;用超纯水定容并稀释得到标准溶液。5mdC的标准溶液质量浓度为0.05、0.25、0.40、1.00和5.00 ng/mL,dG的标准溶液质量浓度为1、5、10和20 ng/mL。5-羟甲基脱氧胞嘧啶DNA标准品为897 bp的DNA片段,其中的胞嘧啶已全部经过处理，转化为5-羟甲基脱氧胞嘧啶(5hmdC)。取5-羟甲基脱氧胞嘧啶DNA标准品,对其进行与提取DNA相同的酶解过程,用超纯水定容并稀释得到标准溶液,其质量浓度为 0.0045、0.0224、0.0448 和 0.2240 ng/mL。
液相色谱条件:Kinetex C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,2.6 μ m,美国Phenomenex公司);流速0.3 mL/min;柱温40 ℃;进样量5 μ L。流动相A:超纯水;流动相B:甲醇。梯度洗脱程序:0～5 min,3%B; 5～6 min,5%B升至100%B; 6～7.5 min,维持100%B; 7.5～7.51 min,100%B降至5%B; 7.51～10 min,维持3%B。
串联质谱条件:电喷雾离子源;正离子扫描;多反应监测(MRM)模式;电喷雾电压 5500 V;离子源温度(TEM)550 ℃;碰撞气(CAD,N2)Medium;气帘气(CUR,N2)30 L/min;雾化气(GS1)55 L/h;辅助加热气(GS2)50 L/h;驻留时间20 ms;入口电压(EP)10 V;监测离子对、去簇电压(DP)和碰撞能量(CE)详见表1。
采用SPSS18.0软件进行统计学分析。大鼠对照组和暴露组中组织样品的DNA甲基化水平和羟甲基化水平采用Wilcoxon符号秩检验进行比较。
本研究比较了乙腈和甲醇作为流动相的分离能力。dG、5mdC和5hmdC均属于强极性化合物,在C18柱上保留较弱。由于乙腈的洗脱能力强于甲醇,即使在低浓度下也无法对这些化合物进行基线分离。我们还考察了甲酸、乙酸铵等添加剂对分离和检测的影响,结果发现这些添加剂并没有显著的改善分离和检测灵敏度。因此,选择甲醇作为流动相。通过进一步优化梯度洗脱条件,dG、5mdC和5hmdC可在4 min内实现基线分离,如图1a~c所示。我们分别对3种核苷的标准溶液进行母离子全扫描,确定其分子离子,并优化各分子离子的去簇电压。然后分别以上述离子为母离子,对其子离子进行全扫描,选择丰度较高、干扰较小的两对子离子为定性离子,丰度最高的作为定量离子,然后优化其碰撞能量,使得分子离子与特征碎片离子产生的离子对强度达到最大时为最佳。
生物DNA样品中胞嘧啶(5mC、5hmC和G)的水平与脱氧胞嘧啶(5mdC、5hmdC和dG)相等,因此,我们通过测定3种脱氧胞嘧啶从而确定胞嘧啶的水平。按实验方法制备标准溶液,按外标法计算样品中5mdC、5hmdC和dG的浓度,并根据下式计算全基因组的DNA甲基化率(MR)和羟甲基化率(HMR):
报道的全基因组DNA甲基化率的计算公式为:MR=100%×(5mdC/(5mdC+dC))[14,15,16]。但是胞嘧啶存在多种修饰形式,甲基修饰只是其中一种[5],因此此计算公式存在一定的误差。鸟嘌呤与不同形式的胞嘧啶进行配对,而且其结构较为稳定,因此本研究中对计算公式进行了修正。
逐步稀释标准溶液进行测试,以信噪比为3和10的要求确定5-甲基脱氧胞嘧啶核苷的检出限(LOD)和定量限(LOQ)分别为0.015和0.045 ng/mL,5-羟甲基脱氧胞嘧啶核苷的LOD和LOQ分别为0.001和0.003 ng/mL,脱氧鸟嘌呤核苷的LOD和LOQ分别为0.2和0.6 ng/mL。
配制0.1、0.8和2.5 ng/mL 的5-甲基脱氧胞嘧啶核苷溶液,0.5、2.5、10 ng/mL 脱氧鸟嘌呤核苷溶液,0.01、0.05和0.2 ng/mL 的5-羟甲基脱氧胞嘧啶核苷溶液。每个浓度均配制5份,依照实验方法进行测定。定量标准曲线和回收率测定结果见表2。
大量流行病学、动物暴露和细胞暴露研究表明砷暴露会显著影响生物体的全基因组DNA甲基化修饰。流行病学研究发现砷暴露浓度与全基因组DNA甲基化水平变化在大部分研究中都不是呈单调的线性关系,动物暴露实验的研究对象主要集中于肝脏,而且在不同物种和不同的暴露浓度得到的全基因组DNA甲基化水平的变化趋势存在差异,不同的细胞暴露实验中也得到不同结论[17,18]。精确的检测方法是进一步研究砷对DNA甲基化水平的影响的基础。在本研究中对大鼠砷暴露浓度为2 mg/L,暴露9周,取其肝脏和小脑按照上述实验方法测定5mdC、5hmdC和dG,并计算全基因组DNA甲基化和羟甲基化水平。典型色谱图见图1d~e,动物组织样品检测结果如图2和图3所示。结果表明砷暴露导致小脑和肝脏中全基因组DNA甲基化率显著升高,而全基因组DNA羟甲基化率未发生显著变化。小脑和肝脏的全基因组DNA甲基化率水平接近,维持在4% ～6%之间;而全基因组DNA羟甲基化率在两个组织中差异较大,小脑中的水平超过了肝脏的3倍以上。
本研究基于液相色谱-电喷雾串联质谱,建立了同时检测生物样品中全基因组DNA甲基化和羟甲基化水平的分析方法。5mdC和5hmdC的检出限和定量限明显优于之前的研究报道[14,16]。通过分 析大鼠肝脏和小脑中全基因组DNA甲基化率和羟 甲基化率表明该方法具有良好的重现性、灵敏度和稳定性。这也为今后同时研究DNA甲基化和羟甲基化提供了有力的支持。
2014, Vol. 32 Issue (7): 682-686
PDF (831 KB)
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