色谱  2014, Vol. 32 Issue (8): 822-826   PDF (971 KB)    
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勾新磊
高峡
胡光辉
刘伟丽
超高效液相色谱-串联质谱法同时测定中成药和保健品中9种抗抑郁药物
勾新磊1, 高峡1,2 , 胡光辉1, 刘伟丽1,2    
1. 北京市理化分析测试中心, 北京 100089;
2. 国家食品质量安全监督检验中心, 北京 100094
收稿日期：2014-3-21
基金项目：北京市自然科学基金项目（2122018）；北京市科学技术研究院创新团队计划项目（IG200801N/C2）.
通讯作者：高峡，E-mail：gaoxia@iccas.ac.cn
摘要：建立了同时测定中成药和保健品中9种抗抑郁药物的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）分析方法。以甲醇为提取溶剂，超声提取，离心后取上清液，使用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）进行分离，以乙腈和0.1%（v/v）甲酸水为流动相对目标物进行梯度洗脱。在电喷雾正离子模式下，采用多反应监测（MRM）模式进行定性和定量分析。结果表明，9种抗抑郁药物在0.04~20 μg/L范围内线性关系良好，线性相关系数（R2）均大于0.998；目标物的检出限为0.0068~0.034 μg/L；在0.5、1、5 μg/L 3个添加水平下的平均回收率为77.7%~100.8%，相对标准偏差为0.9%~9.1%。本方法准确、简便、快速，可用于中成药和保健品中抗抑郁药物的检测。
关键词： 超高效液相色谱-串联质谱     抗抑郁药物     中成药     保健品    
Simultaneous determination of nine antidepressants in traditional Chinese medicines and health food by ultra performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry
GOU Xinlei1, GAO Xia1,2 , HU Guanghui1, LIU Weili1,2    
1. Beijing Centre for Physical and Chemical Analysis, Beijing 100089, China;
2. China Food Quality Safety Supervision and Inspection Center, Beijing 100094, China
Received: 2014-3-21
Abstract: A sensitive method was developed for the simultaneous determination of nine antidepressants in traditional Chinese medicines and health food by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) based on the sonication-assisted extraction. The separation was performed on a Waters ACQUITY UPLC BEH C18 column (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm) by using 0.1% (v/v) formic acid aqueous solution and acetonitrile as the mobile phases with gradient elution at a flow rate of 0.2 mL/min. The electrospray ionization (ESI) source in positive ion mode was used for the analysis of the nine antidepressants in the multiple reaction monitoring (MRM) mode. The standard curves for the nine antidepressants were obtained with good correlation coefficients (R2>0.998) in the concentration range of 0.04-20 μg/L. The limits of detection for the nine antidepressants were in the range of 0.0068-0.034 μg/L. The average recoveries at three spiked levels (0.5, 1, 5 μg/L) were 77.7%-100.8% with the relative standard deviation of 0.9%-9.1%. The method is accurate, simple, rapid and feasible for the simultaneous determination of the antidepressants in traditional Chinese medicines and health food.
Key words: ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS)     antidepressants     traditional Chinese medicines     health food    

抑郁症是一种常见的心理障碍,临床表现为持续悲观、心情低落、思维迟缓,部分患者会伴有狂躁、焦虑、失眠等症状[1, 2],市场上一些中成药及保健品可以治疗或缓解这些症状。一些商贩在利益驱动下向其中非法添加抗抑郁药物成分以增强疗效,患者长期使用会产生药物依赖,使用不当会危害身体健康,甚至危及生命[3]。因此建立中成药和保健品中抗抑郁药物的检测方法,对打击制假贩假行为、保护人民身体健康具有重要意义。

目前,中成药和保健品中精神类药物的检测方法有薄层色谱法(TLC)[4]、液相色谱法(LC)[5]、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[6, 7, 8]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17]等。但TLC检测结果假阳性率高;LC灵敏度较低;GC-MS虽然灵敏度高,但是部分药物需要进行繁琐费时的衍生化前处理;而LC-MS/MS方法因具有灵敏度高、检出限低的特点,可以进行多组分定性、定量检测,是目前报道较多的方法。现有文献[9, 10]主要针对苯二氮类、巴比妥类等镇静安神类药物进行检测,而对于中成药和保健品中添加的能缓解烦躁、焦虑等症状的抗抑郁药物的检测,目前还未见报道。本文建立了同时检测中成药和保健品中9种抗抑郁药物的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)分析方法。该方法准确、简便、快速,为中成药和保健品中抗抑郁药物的检测及监控提供了科学依据和技术支持。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

Acquity超高效液相色谱仪,Xevo TQ串联质谱仪,Masslynx 4.1工作站(美国Waters公司); KQ6000V超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司); CR22GⅢ离心机(日本日立公司); Milli-Q超纯水器(美国Millipore公司)。

西酞普兰、多塞平、帕罗西汀、氟伏沙明、马普替林、阿米替林、氟西汀、舍曲林、氯米帕明(纯度均≥97% ,中国药品生物制品检定所);甲醇、乙腈、正己烷为色谱纯(美国Fisher公司);二氯甲烷、丙酮为色谱纯(安徽时联公司);实验用水为经Milli-Q超纯水器过滤的去离子水;其他试剂均为分析纯。样品随机购自药店及超市。

1.2 标准溶液配制

分别准确称取适量上述标准物质,置于不同容量瓶中,用甲醇溶解,制得质量浓度均为 1000 mg/L 的单标准储备液。准确移取各单标准储备液0.1 mL,置于100 mL容量瓶中,用甲醇定容,配制成1 mg/L 的混合对照品储备液。所有标准溶液均在4 ℃下保存。

1.3 样品处理

称取1.0 g样品(片剂碾碎,胶囊去壳研细),置于50 mL具塞离心管中,加入20 mL甲醇,超声提取20 min,以 10000 r/min 的速率离心10 min,取上清液,经0.22 μ m有机滤膜过滤后,用UPLC-MS/MS检测。

1.4 色谱和质谱条件

色谱柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μ m;美国Waters公司);流动相:A为0.1%(v/v,下同)甲酸水溶液,B为乙腈;流速:0.2 mL/min;柱温:35 ℃;梯度洗脱程序:0～1.0 min,20%B; 1.0～7.0 min,20%B～70%B; 7.0～8.0 min,70%B; 8.0～8.5 min,70%B～20%B; 8.5～10.0 min,20%B。

离子源:电喷雾离子源(ESI);扫描方式:正离子扫描;检测方式:多反应监测(MRM)模式;毛细管电压:3.0 kV;萃取电压:5.0 V;离子源温度:150 ℃;脱溶剂气温度:350 ℃;脱溶剂气流速:650 L/h;锥孔气流速:20 L/h。其他具体实验参数见表1。

表1 9种抗抑郁药物的UPLC-MS/MS参数和保留时间 Table 1 UPLC-MS/MS parameters and retention times for the nine antidepressants
2 结果与讨论
2.1 质谱条件的选择及裂解规律的研究

在ESI模式下,使用蠕动泵以5 μ L/min 的速度依次将9种抗抑郁药物的单标准溶液分别注入质谱的离子源中,测定其在正离子(ESI+)、负离子(ESI-)模式下的质谱信号强度。实验结果表明,在ESI+模式下,9种抗抑郁药物均可获得较高丰度的[M+H]+准分子离子峰。依据食品法典委员会和欧盟第 2002/657/EC号[18]文件的有关规定,选择2对离子进行MRM监测。确定母离子后,采用子离子扫描方式进行二级质谱分析,对子离子进行优化选择,以确定定量离子和定性离子。然后根据选择的子离子对离子源温度、脱溶剂气温度及流量和锥孔气流量进行优化,使目标物质的离子化效率达到最佳。9种抗抑郁药物定量离子的裂解规律见图1。

图1 9种抗抑郁药物定量离子的裂解途径 Fig.1 Fragmentation pathways of quantitative ions of the nine antidepressants
2.2 色谱条件的选择

实验采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18分离柱,分别比较了甲醇和乙腈作为有机相,水、0.1%甲酸水、5 mmol/L 乙酸铵作为水相的分离效果。实验表明:使用甲醇为有机相,目标物保留时间相对较长;乙酸铵作为水相,目标物质响应差;乙腈-0.1%甲酸水作为流动相效果最好。在流动相中加入0.1%甲酸水,有助于化合物的离子化,使目标物响应增大,提高灵敏度。采用梯度洗脱,可提高抗抑郁药物各组分在色谱柱中的分离效率。

图2为9种抗抑郁药物(质量浓度为10 μ g/L)的总离子流图。

图 2 9种抗抑郁药物(10 μ g/L)的总离子流色谱图 Fig.2 Total ion chromatogram of the nine antidepressants (10 μ g/L) Peaks: 1. citalopram; 2. doxepin; 3. paroxetine; 4. fluvoxamine; 5. maprotiline; 6. amitriptyline; 7. fluoxetine; 8. sertraline; 9. clomipramine.
2.3 提取溶剂的优化

本文分别考察了甲醇、丙酮、二氯甲烷和正己烷作为提取溶剂时各个目标化合物的提取效果,结果见表2。

表 2 不同提取溶剂的提取效果对比 Table 2 Comparison of the extraction results by different extraction agents

由表2可以看出，使用甲醇作为提取溶剂时,9种抗抑郁药物的提取效率最佳,且超声提取后快速离心,操作方便,简化了样品前处理过程。

2.4 方法的线性关系和检出限

以空白片剂样品的提取液作为标准溶液的稀释溶液,精确配制0.04～20 μ g/L 范围内的一系列不同浓度的混合标准工作溶液,在优化的色谱条件和质谱条件下进行测定。分别以各分析物的峰面积(Y)和对应的质量浓度(X,μ g/L)进行线性回归计算,得到线性回归方程和线性相关系数(R2)。以特征离子色谱峰的S/N≥3为标准确定方法的检出限,以S/N≥10为标准确定方法的定量限,结果如表3所示。9种抗抑郁药物在0.04～20 μ g/L 质量浓度范围内呈现良好的线性关系,相关系数均大于0.998,检出限为 0.0068～0.034 μ g/L,说明本方法适用于中成药和保健品中9种抗抑郁药物的定量分析。

表 3 9种抗抑郁药物的线性方程、相关系数、检出限和定量限 Table 3 Linear equation,correlation coefficients (R2),limits of detection (LOD) and limits of quantitation (LOQ) of the nine antidepressants
2.5 加标回收率和精密度

以空白中成药胶囊和片剂保健品为样品,分别添加0.5、1、5 μ g/L 3个浓度的混合标准溶液,进行添加回收率和精密度实验,每个浓度水平平行测定6次。结果如表4所示,在3个浓度水平下,各待测物的平均回收率为77.7% ～100.8% ,相对标准偏差为0.9% ～9.1% ,能满足中成药和保健品中9种抗抑郁药物的测定要求。

2.6 样品分析

利用本方法分别对市售的康富丽牌褪黑素软胶囊(广州三九科工贸实业发展公司,批号为20120210)、清华紫光褪黑素片(威海生原药业有限公司,批号为12021501)、解郁安神胶囊(吉林百姓堂药业有限公司,批号为20120904)、蒲郁胶囊(四川诺迪康威光制药有限公司,批号为130102)和舒神灵胶囊(长春海外制药集团有限公司,批号为20110201)进行了检测,所有样品中均未检出上述9种抗抑郁药物。

表 4 9种抗抑郁药物在3个加标水平下的平均回收率和精密度(n=6) Table 4 Recoveries and precisions of the nine antidepressants at three spiked levels (n=6)
3 结论

本文建立了超高效液相色谱-串联质谱法同时测定中成药和保健品中9种抗抑郁药物的分析方法。该方法准确、简便、快速,可用于中成药和保健品中抗抑郁药物的实际检测。

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