从1903年俄国植物学家Tswitt开创色谱法至今,色谱技术已经经历了110多年的发展。其中高效液相色谱法因其高效、温和及适用范围广等优点而得到快速发展和广泛应用,目前成为生物医药、食品检测、环境监测、毒品和化学化工分析等领域的重要检测工具[1, 2, 3, 4]。色谱分离过程是被分析物、流动相和固定相三者之间的分子识别过程,固定相是色谱分离的核心,固定相分离材料的制备和应用始终是色谱工作者研究的前沿和热点之一[4, 5, 6]。在各类液相色谱分析中,采用化学键合固定相的占据主流地位,其中应用最广的是十八烷基硅烷键合硅胶固定相(C18或ODS)。十八烷基柱具有柱效高、稳定性好、适用范围广和使用方便等优点[2],正是这类固定相的广泛应用丰富和促进了反相高效液相色谱理论和技术的进步。然而,随着生物、制药、食品和环境等领域检测对象的日趋多样化和复杂化,十八烷基固定相也显示出其局限性,如对含强极性、离子型、生物大分子等复杂样品的直接分离不够理想[7, 8, 9]。王俊德等[9]认为制备反相键合硅胶固定相需要解决一个突出问题,那就是如何克服或屏蔽残存硅羟基对溶质(尤其是碱性化合物)分离的负面影响。因此,发展多齿型配体固定相和制备新型的多功能多作用位点的液相色谱固定相是解决上述问题的重要途径。例如,近年来李来生实验室[10, 11, 12, 13]研发出了多种以天然产物为配体的多作用位点新型固定相并初步展现了该类固定相的应用优势。然而该类固定相要得到广泛应用,需进一步提高固定相上配体的键合量和色谱性能的稳定性。本实验在陈会明等[10]工作的基础上,对合成方法进行改进。陈会明等采用固液相表面连续反应法,先将偶联剂KH-560键合到硅胶表面,然后再将大黄素与硅胶上的KH-560活性基团反应制得大黄素键合硅胶液相色谱固定相(以下简称ESP)。该法可较方便地进行结构表征和除去每步反应后多余的偶联剂和配体,但键合量较低。本实验改为采用中间体法,先将大黄素与KH-560反应,然后再键合到硅胶上制得ESP。实验发现所得的ESP上大黄素的键合量有所提高,色谱性能更好,且制备方法有较好的重现性。
美国Agilent 1260高效液相色谱系统包括四元泵、柱温箱、二极管阵列检测器、OpenLAB CDS ChemStation工作站和手动进样器(20 μ L进样环);RPL-ZD10装柱机(大连日普利科技有限公司); IR Affinity-1傅里叶变换红外光谱仪(日本岛津公司); Vario ELⅢ型元素分析仪(德国Elementar公司); DTG-60差热-热重同时分析装置(日本岛津公司); SZ-93自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂);大黄素键合硅胶色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μ m,自制);用于对照研究的C18色谱柱(ZORBAX Eclipse XDB-C18,150 mm×4.6 mm,5 μ m)和苯基色谱柱(ZORBAX Eclipse XDB-Phenyl,250 mm×4.6 mm,5 μ m),购于美国安捷伦科技有限公司。
大黄素(纯度≥98% ,贵州迪大科技有限责任公司),γ -[(2,3)-环氧丙氧]丙基三甲氧基硅烷(KH-560)(纯度≥98% ,武汉市华昌应用技术研究所),球形硅胶(粒径5 μ m,孔径10.8 nm,比表面积为236 m2/g,青岛美高化工有限公司),甲醇(西陇化工股份有限公司,色谱纯),水仙牌风油精(漳州水仙药业有限公司),其他试剂均为分析纯,双重蒸馏水。
固定相的制备路线见图1。以5 μ m的球形硅胶为基质,先用3 mol/L 盐酸活化硅胶,再用二次蒸馏水洗至中性,最后用丙酮洗涤后于160 ℃烘干除水活化6 h,得活化硅胶备用。
取1.0 g经烘干的大黄素加入100 mL无水甲苯(金属钠除水)中,加热搅拌使其溶解,搅拌下加入4.0 mL KH-560和1滴高氯酸,在N2保护下加热回流24 h,趁热过滤,滤液为反应得到的大黄素偶联剂(见图1中的制备产物(2))。搅拌下向滤液中加入4.0 g经活化的干燥硅胶和3滴三乙胺(重蒸),在N2保护下加热回流24 h,冷却,离心,将固体依次用甲苯、甲醇、丙酮反复洗涤至洗液为无色透明,70 ℃下真空干燥8 h,得大黄素键合硅胶固定相(见图1中的制备产物(3))。
采用红外光谱、元素分析和差热分析表征ESP固定相的结构。
采用匀浆法装柱。取稍多于柱体积的大黄素键合硅胶固定相(约2.2 g),用异丙醇作均浆剂,超声制备均匀悬浊液。取2.5 mL甲醇装入均浆罐中打底,再把悬浊液倒入均浆罐,然后用甲醇填满均浆罐,迅速将均浆罐上螺帽栓紧,开启装柱机泵,维持压力在40～50 MPa一段时间,当流出液约为100 mL时将压力调至35 MPa左右保持40 min,然后在30 min内逐渐降压至常压。新ESP柱用甲醇反复冲洗以除去固定相上吸附的杂质,然后用甲醇作流动相平衡,待基线平稳后进样分析。所用流动相使用前先过滤,超声脱气15 min,溶质先用甲醇溶解经0.45 μ m滤膜过滤,质量浓度范围为50～250 mg/L,进样体积一般为5 μ L,以甲醇溶剂峰的保留时间为死时间,柱温为32 ℃,流速为0.8 mL/min,至少平行测定2次。
本实验采用中间体法制备ESP,即配体先与偶联剂反应制备含配体的硅氧烷试剂,然后再与硅胶键合最终制得ESP固定相。ESP的红外光谱图显示,位于 3500 cm-1左右的硅羟基伸缩振动强峰信号较弱,说明硅胶表面的硅羟基参与了偶联反应;2949.16、2891.30 cm-1处为饱和C-H伸缩振动吸收峰,表明硅胶表面含有机物;1745.58、1629.85 cm-1峰簇是C=O和芳环骨架C=C偶合振动吸收带,即羰基和苯环存在;1104.28 cm-1附近为Si-O及C-O伸缩振动重叠吸收带。以上信息说明硅胶表面已键合上大黄素配体。由元素分析测得ESP的碳和氢平均质量百分含量分别为10.45%和1.663%(见表1),根据碳含量计算出配体键合量为0.23 mmol/g(已扣除单纯的偶联剂键合硅胶碳含量6.385% )。热重分析(30～750 ℃,10 ℃/min)测得ESP失重19.23% ,而偶联剂键合硅胶失重12.49% ,计算出的键合量与元素分析结果基本相符。以上结果表明,与陈会明等[10]采用连续反应法(偶联剂先键合到硅胶表面,然后将配体与偶联剂键合硅胶反应,最终配体键合量为0.18 mmol/g)制备大黄素固定相相比,本法能明显提高大黄素配体的键合量和实验效率。
柱效是色谱柱重要的指标,它与测试条件和溶质的选择有关。本实验采用萘作为溶质探针,以甲醇-水(60 ∶ 40,v/v)为流动相,流速为0.8 mL/min,25 ℃时测得萘在ESP柱上的保留时间为11.899 min,计算其理论塔板数为 19874 N/m,高于前人的报道[10]。但低于相同条件下商品化C18柱和苯基柱的理论塔板数(分别为 98413 N/m和 96268 N/m)。
采用甲醇和甲醇-0.01 mol/L KH2PO4(60 ∶ 40,v/v,pH=3)反复交替冲洗ESP柱长达一周,发现萘的保留时间变化很小,柱效变化不大,说明ESP色谱柱键合层稳定,溶质保留时间重现性好。
以苯、甲苯、乙苯为溶质探针,以C18柱和苯基柱为参比,考察了ESP柱的疏水性。结果表明,烷基苯的lg k与亚甲基数(n)之间有较好的线性关系,基本符合碳数规律。ESP柱的线性斜率p= 0.1747,线性相关系数r= 0.9943,疏水选择性因子 α 2,1=1.42;相比相同条件下C18柱(p=0.3406,r=0.9988,α 2,1=2.09)和苯基柱(p=0.2299,r=0.9996,α 2,1=1.73)可知,ESP具有典型的反相色谱特征,3根色谱柱的疏水性大小依次为C18柱＞苯基柱＞ESP柱,ESP的疏水性较小是由配体本身含有极性基团和键合量较低所致。
从图2中发现,在流动相为甲醇-水(50 ∶ 50,v/v)时,7种芳香族化合物在ESP柱上达到良好分离,而在C18柱上要实现良好分离必须将流动相中甲醇含量提高到65% ,否则乙基苯和邻苯二甲酸二丁酯在C18柱上保留时间过长,85 min仍未见出峰。在相同的色谱条件(甲醇-水为50 ∶ 50)下,除邻苯二甲酸二丁酯以外,其他6种溶质在苯基柱上基本实现分离；但邻苯二甲酸二丁酯在85 min内未能洗脱出来,若提高有机相甲醇的含量,则邻苯二甲酸二丁酯能较快洗脱但又会影响其他溶质的有效分离。因此在苯基柱上要实现7种溶质的良好分离必须采用较复杂的梯度洗脱程序。可见,与C18柱和苯基柱相比,ESP具有在更低的甲醇比例和更短的时间内将中性芳香化合物完全分离的良好色谱性能。
由图2a可以看到,溶质在ESP柱的保留时间长短依次为:喹啉＜苯＜甲苯＜乙基苯＜溴代苯＜邻苯二甲酸二丁酯＜萘。其中喹啉、苯、甲苯、乙基苯和邻苯二甲酸二丁酯5种溶质在ESP柱的洗脱顺序与在C18柱上(图2b)相同,而溴代苯和萘则不同,说明中性溶质在ESP柱上的分离主要基于疏水作用,同时也存在其他的作用机制。ESP的偶联剂链和蒽醌环提供了疏水性的结构基础,同时配体中的蒽醌环和羰基也提供了丰富的 π 键和孤电子对,能与溶质发生 π - π 或p- π 电荷转移作用。由于萘的共轭体系大,苯环上电子密度大,与蒽醌环 π - π 作用强,故最后被洗脱。ESP与溴代苯和萘的 π - π 电荷转移作用增强,从而在ESP上的保留也随之增强。这种 π - π 电荷转移作用导致保留增强的现象同样发生在苯基柱对含芳环溶质的分离中(图2c),与ESP相比,由于苯基柱固定相中配体含量高和装柱技术成熟,其 π - π 共轭和疏水相互作用均强于ESP,从而使得溶质在苯基固定相上的洗脱顺序有别于单纯靠疏水作用机制的C18固定相以及存在多种作用机制的ESP。相同色谱条件下,各溶质在苯基柱上的保留时间都比在ESP上长,在对喹啉和苯的分离中电荷转移作用占主导,苯先于喹啉洗出,而在对乙基苯、溴代苯、邻苯二甲酸二丁酯和萘的分离中显然疏水作用为主导作用,洗脱时间为溴代苯＜乙基苯＜萘＜邻苯二甲酸二丁酯。
图3展示了烟酰胺等6种碱在ESP柱、C18柱和苯基柱上的洗脱顺序。由于疏水相互作用是溶质在C18柱上唯一的作用机制,溶质在C18柱上的保留时间依照其疏水性大小依次为:烟酰胺＞邻苯二胺＞苯胺＞对硝基苯胺＞对甲苯胺＞1-萘胺。在苯基柱中,虽然溶质与固定相还存在 π - π 电荷转移作用,但疏水作用占支配地位,溶质的洗脱顺序与C18柱一致。在ESP柱中疏水作用仍为主导作用,使得大部分溶质的洗脱顺序与C18柱一致,但也有例外,例如:对甲苯胺的疏水性明显强于对硝基苯胺,但对甲苯胺在ESP柱上的保留反而弱于对硝基苯胺,显然带有吸电基的对硝基苯胺比带有供电基的对甲苯胺与ESP发生了更强的电荷转移、氢键和偶极-偶极作用,这些作用的影响强于两者疏水性的差异,使得在ESP上对硝基苯胺的保留强于对甲苯胺。另外,在该色谱条件下,C18柱单一的疏水作用机制难以将苯胺和对硝基苯胺分开(分离度R=0.60),并且对1-萘胺的保留比ESP柱和苯基柱弱。若要实现6种胺类在C18柱上的有效分离,则必须将流动相中甲醇的体积分数降至35% ,但此时6种溶质的分离分析时间将增加一倍。因此,ESP对溶质的多种保留机制使其在碱性物质的分离中比C18柱更具有优势。ESP柱和苯基柱不完全相同的固定相结构也导致了两者不同的色谱表现。另外值得注意的是,偶联剂间隔臂的屏蔽作用和大黄素配体的立体保护效应有效地抑制了硅胶键合固定相的“亲硅醇基效应”,无需添加缓冲盐,采用简单的甲醇-水流动相,碱性溶质在未经封尾处理的ESP柱上的峰形较对称,可以与商品化的C18柱和苯基柱媲美。
对比对氨基苯酚等7种酚类化合物在ESP柱、C18柱和苯基柱上的色谱图(见图4)发现,除对氨基苯酚外的6种溶质在3种固定相上的洗脱顺序一致,均符合其疏水性大小顺序:对苯二酚＜间苯二酚＜苯酚＜邻甲酚＜ β -萘酚＜ α -萘酚。说明6种酚类化合物在ESP柱和苯基柱上的分离也主要基于疏水相互作用,但同时也存在其他相互作用。例如：由于苯基柱固定相与溶质还存在 π - π 电荷转移作用,使得在苯基柱上疏水性稍强的间苯二酚反而先于对氨基苯酚被洗脱出来；而ESP上除了具有能产生 π - π 电荷转移作用的大黄素蒽醌环,同时固定相上的羰基和羟基能与溶质发生氢键作用、偶极-偶极作用,多种作用力协同作用的结果使得在ESP柱上疏水性稍弱的邻苯二酚反而慢于对氨基苯酚被洗脱出来。从溶质的保留时间分析,在相同色谱条件下,柱长为150 mm的C18柱对 β -萘酚和 α -萘酚的保留时间最长,相同柱长的ESP柱次之,而柱长达250 mm苯基柱保留时间却最短。可见,多种保留机制使ESP柱对 β -萘酚和 α -萘酚的保留明显强于苯基柱,ESP柱在上述溶质分离中显示出与C18柱和苯基柱明显不同的分离效率和选择性；7种溶质在ESP和苯基柱上具有较理想的分离度。
风油精是百姓家中必备的良药,具有清凉、止痒、消炎、镇痛和驱风等功效,其主要有效成分为薄荷脑、水杨酸甲酯、丁香酚、樟脑、桉油等[14]。其中,水杨酸甲酯可促进局部血液循环,起消肿、消炎、止痒和镇痛作用;丁香酚则具有抑菌、麻醉、解热、抗氧化、抗肿瘤、促进透皮吸收等功效。对风油精中丁香酚和水杨酸甲酯两种主要成分的测定有助于风油精质量的监控。由图5可看出,在ESP上疏水作用较强的水杨酸甲酯洗脱较慢,而极性较强的丁香酚最先被洗脱,这相应于ESP反相色谱本质,即以疏水作用机理为主；5 min内就能实现两组分良好的分离,说明多作用位点的ESP柱在针对极性较强的样品分离分析方面有应用优势。
上述结果表明,ESP固定相具有明显的反相色谱性能,对溶质的分离主要基于疏水相互作用。同时由于大黄素配体中含有蒽醌环、羰基和羟基,丰富的 π 键和孤电子对与溶质间能发生 π - π 或p- π 电荷转移作用、氢键作用以及偶极-偶极作用,多种作用力的分离机制使得ESP能够克服C18柱单一疏水作用的缺陷,改进苯基柱没有氢键及其他丰富的作用位点的缺陷,在对中性、碱性和酸性化合物的分离中显示其优异的选择性和分离性能,ESP在对不同结构特征和性质的芳香化合物的有效、简便和快速分离分析方面具有广阔的应用前景。
2014, Vol. 32 Issue (8): 798-803
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