色谱  2014, Vol. 32 Issue (9): 1005-1012   PDF (1417 KB)    
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叶曦雯
彭燕
牛增元
高永刚
罗忻
邹立
周明辉
超高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱高分辨质谱鉴别纺织品中禁用芳香胺及其异构体
叶曦雯1 , 彭燕2, 牛增元1, 高永刚1, 罗忻1, 邹立2, 周明辉3    
1. 山东出入境检验检疫局, 山东 青岛 266002;
2. 中国海洋大学环境科学与工程学院, 山东 青岛 266100;
3. 广东出入境检验检疫局, 广东 广州 510623
收稿日期：2014-4-24
基金项目：国家质检公益性行业科研专项基金项目（201310062）；“双打”中急需的出入境检验检疫技术方法研究项目（2012104020）；国家质检总局科研项目（2013IK015）.
通讯作者：叶曦雯，E-mail: ye.xiwen@163.com.
摘要：针对目前纺织品中禁用偶氮染料检测中的假阳性问题，建立了一套应用超高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱高分辨质谱（UPLC-LTQ/Orbitrap）同时筛选24种禁用芳香胺及其常见的14种异构体的方法。样品经连二亚硫酸钠还原，叔丁基甲醚提取后，以水/甲醇（9/1，v/v）稀释定容，用ZORBAX SB-C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，5 μm）分离，以0.1%甲酸水溶液和甲醇为流动相，电喷雾正离子（ESI+）模式电离。以准分子离子峰的精确质量数和保留时间定性，以提取的色谱图峰面积定量。38种芳香胺的线性相关系数大于0.99，方法检出限为0.5~5 μg/kg。该方法可通过一次实验同时对24种禁用芳香胺及其常见的14种异构体准确定性定量，大大缩短检测周期，实际样品检测也进一步验证了其灵敏性和准确性。
关键词： 超高效液相色谱     线性离子阱/静电场轨道阱质谱     高分辨质谱     禁用偶氮染料     同分异构体     纺织品    
Identification of banned aromatic amines and their isomers in textiles by ultra-performance liquid chromatography-linear ion trap/orbitrap high resolution mass spectrometry
YE Xiwen1 , PENG Yan2, NIU Zengyuan1, GAO Yonggang1, LUO Xin1, ZOU Li2, ZHOU Minghui3    
1. Shandong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Qingdao 266002, China;
2. College of Environmental Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266100, China;
3. Guangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Guangzhou 510623, China
Received: 2014-4-24
Abstract: A method of ultra-performance liquid chromatography-linear ion trap/orbitrap high resolution mass spectrometry (UPLC-LTQ/Orbitrap MS) was used to screen and confirm 24 banned aromatic amines and their 14 isomers at the same time. The main factors influencing the separation including the column, and the nature of make-up solvent were optimized. Under the optimized experimental conditions, the analytes were reduced to banned aromatic amine with sodium dithionite, extracted by methyl tert-butyl ether and loaded onto a ZORBAX SB-C18 column (150 mm×2.1 mm, 5 μm) with a gradient elution of methanol and 0.1% formic acid aqueous solution, and finally detected by LTQ/Orbitrap MS. The screening and quantitative analysis were carried out by the accurate mass of quasi-molecular ion and the peak in extracted chromatogram with accurate mass. The correlation coefficients were higher than 0.99 and the limits of detection were in the range of 0.5-5 μg/kg. The method could screen and confirm the 24 banned aromatic amines and their 14 isomers at the same time. The results were 1.56 mg/kg of 4-chloroaniline, 0.34 mg/kg of o-toluidine, and 0.81 mg/kg of 2,6-toluylenediamine with the relative standard deviations ranging from 0.27% to 1.32% in actual samples. The results indicate that the developed method is simple, efficient and precise, and can be a reliable technique for the separation of the 24 banned aromatic amines and their 14 isomers in textile samples.
Key words: ultra-performance liquid chromatography (UPLC)     linear ion trap/orbitrap mass spectrometer (LTQ/Orbitrap MS)     high-resolution mass spectrometry (HRMS)     banned azo dyes     isomers     textile    

禁用偶氮染料在一定条件下可以还原出致癌芳香胺,这些致癌芳香胺通过改变人体DNA结构,最终引起人体病变和诱发癌症[1]。目前,Oeko-Tex Standard 100生态纺织品标准[2]、Eco-label生态纺织品标签[3]以及我国GB 18401-2010《国家纺织产品基本安全技术规范》[4]等对纺织品中的禁用芳香胺都有明确规定。在实际检测中,这些禁用芳香胺存在多种同分异构体,然而这些同分异构体不在禁用之列,异构体的存在带来的假阳性问题,给日常检测工作增加了困难。

纺织品中24种禁用芳香胺的日常检测主要采用气相色谱-质谱联用法(GC-MS),且大都采用非极性或极性较弱的色谱柱,如HP-5MS和DB-5MS等[5],部分禁用芳香胺与其同分异构体在此条件下的色谱保留行为和质谱图都很相似,很容易导致假阳性问题的产生。GB/T 17592-2011《纺织品禁用偶氮染料的检测》[6]中规定:“必要时,选用另外一种或多种方法对异构体进行确认”。但对其中的哪些禁用芳香胺检出时可能会因异构体的存在而影响检测结果并未说明[7]。日常检测中,通常采用高效液相色谱-二极管阵列检测(HPLC/DAD)对检出的禁用芳香胺进一步定性。采用两种方法互补分析既延长了检测周期又增加了检验成本,降低了检验的效率。至今,很多关于禁用芳香胺与其异构体的分离研究[5, 8, 9, 10]都无法在一种条件下将所有禁用芳香胺及其异构体同时分离开来,因而没有得到全面有效的解决方案。

本文结合欧盟对纺织品的REACH(欧盟法规《化学品的注册、评估、授权和限制》)召回案例及国内相关机构检测结果,统计出近年来检出频率较高的禁用芳香胺主要有13种,这其中11种存在异构体,而市场有售标准品的仅为其中8种芳香胺的14种异构体。本文建立了一套应用超高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-LTQ/Orbitrap MS)同时筛选24种禁用芳香胺及其常见的14种异构体的方法。该方法利用一种检测仪器、一次检测实现了禁用芳香胺与非禁用的同分异构体有效分离,有效消除了同分异构体对检测的干扰。该技术应用于实际检测有利于禁用芳香胺的准确定性定量,有效提高检测效率。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

ACQUITY Ultra Performance LC超高效液相色谱仪(Waters公司),LTQ-Orbitrap XL线性离子阱-静电场轨道阱组合质谱仪(Thermo公司),6890N/5975C型气相色谱/质谱联用仪(美国Agilent公司),SHA-B型恒温振荡器(国华仪器),0.22 μ m聚四氟乙烯(PTFE)滤膜过滤头(DIKMA公司),叔丁基甲醚、甲醇(色谱纯,Merck公司),甲酸(色谱纯,Fluka公司),芳香胺标准品(纯度>99%，美国Aldrich公司)。

24种芳香胺及其14种异构体标准溶液:分别准确称取适量的各标准品,用甲醇溶解并定容,配制成有效质量浓度为 1500 mg/L 的标准储备液,于-18 ℃下保存,使用时,用甲醇逐级稀释成标准中间液,现用现配。

1.2 实验方法
1.2.1 样品前处理

参照GB/T 17592-2011或EN14362-1-2012对样品进行前处理,取10 μ L叔丁基甲醚的最终定容液并用水/甲醇(9/1,v/v)稀释定容至1 mL,用于上机检测。

1.2.2 色谱条件

ZORBAX SB-C18色谱柱(150 mm×2.1 mm,5 μ m);流动相A为0.1%甲酸水溶液,B为甲醇;线性梯度洗脱程序:0～1 min,95%A～90%A; 1～5 min,90%A～70%A; 5～6 min,70%A～5%A,保持4 min; 10～10.1 min,5%A～95%A,保持5 min。流速：0.25 mL/min;柱温:30 ℃;样品室温度:15 ℃;进样量:10 μ L。

1.2.3 质谱条件

可加热的电喷雾离子源(HESI-Ⅱ);毛细管温度350 ℃;鞘气(N2)压力206.7 kPa,辅助气(N2)流量3.3 L/min;正离子模式:喷雾电压3 kV,毛细管电压30 V,管状透镜电压80 V。扫描方式:全扫描，分辨率为R=30000。

24种禁用芳香胺及其14种同分异构体的UPLC-LTQ/Orbitrap MS分析参数见表1。化合物筛选的离子提取窗口宽度为5×10-6 (5号和6号经还原后分别分解为邻甲苯胺和2,4-二氨基甲苯)。

表 1 24种禁用芳香胺及其14种同分异构体的UPLC-LTQ/Orbitrap MS分析参数 Table 1 UPLC-LTQ/Orbitrap MS analysis parameters of the 24 banned aromatic amines and their isomers
2 结果与讨论
2.1 常见的含异构体的禁用芳香胺

自2005年1月1日我国正式实施国家强制标准《国家纺织产品基本安全技术规范》[4],禁用了含有23种致癌芳香胺的偶氮染料以来,整体印染产品的质量得到了全面改观,禁用偶氮染料的检出率由之前的约10%下降到1%左右,检出的芳香胺种类也大大下降[11]。本文统计了本实验室和3家检测机构近3年来禁用偶氮染料的检出情况以及REACH召回案例中共89次阳性检出结果(见表2)， 共计检出禁用芳香胺13种,其中4-氯邻甲苯胺(3号)和4,4′-亚甲基-双-(2-氯苯胺)(15号)和2-甲氧基苯胺(21号)仅检出一次,检出频率低;其他10种禁用芳香胺都有不同程度的检出,检出频率较高。

表 2 禁用芳香胺的检出情况 Table 2 Detection times of banned aromatic amines

24种禁用芳香胺中共有14种存在同分异构体,如4-氨基联苯、联苯胺、4-氯邻甲苯胺等。结合表2列出的日常检出情况,本文筛选出了日常检测检出频率较高,同时市场上有售的8种禁用芳香胺的14种异构体(根据相关报道[12, 13],将2-甲氧基苯胺予以保留),并对其在GC-MS(HP-5MS色谱柱)上的分离情况进行了考察，结果见表3。结果发现,邻甲苯胺与间甲苯胺无法分离,对氯苯胺与间氯苯胺、2,4-二氨基甲苯与2,6-二氨基甲苯无法完全分离,即单独采用GC-MS分离,无法达到对所有禁用芳香胺及异构体的一次性分离。

表 3 部分禁用芳香胺及其异构体的GC-MS分离情况 Table 3 The detection of some banned aromatic amines and their isomers on GC-MS
2.2 色谱条件的优化
2.2.1 色谱柱的优化

为了实现24种芳香胺及其14种同分异构体的有效分离,根据相关文献[14],本文采用0.1%甲酸水溶液和甲醇为流动相,比较了在ZORBAX SB-C18色谱柱(15 cm×2.1 mm,5 μ m)和Thermo C18色谱柱(10 cm×2.1 mm,5 μ m)上的分离效果,结果发现,两种不同品牌不同型号的色谱柱仅对邻甲苯胺、2,4-二氨基甲苯、2-甲氧基苯胺及其异构体的分离影响较大,而对其他芳香胺及其异构体无显著影响,如图1所示,采用ZORBAX SB-C18色谱柱可以更好地对该3种物质进行分离。因此,本文选用15 cm的ZORBAX SB-C18色谱柱。

图1 采用ZORBAX SB-C18和Thermo C18色谱柱时的分离效果 Fig.1 Chromatograms on ZORBAX SB-C18 and Thermo C18 columnsa. o-toluidine and its isomers; b. 2,4-toluylenediamine and its isomers; c. 2-methoxyaniline and its isomers.
ZORBAX SB-C18 column: 15 cm×2.1 mm,5 μ m; Thermo C18 column: 10 cm×2.1 mm,5 μ m.
2.2.2 定容溶剂的选择

实际样品检测过程中,芳香胺的提取试剂是叔丁基甲醚。据文献[15]报道,在用液相色谱法检测禁用芳香胺时可以用叔丁基甲醚提取液直接进样分析,无需更换为甲醇,既节约成本又提高了检测效率。

基于此,本文对比了采用水/甲醇(9/1,v/v)和叔丁基甲醚分别作为溶剂时的色谱分离,结果发现,采用叔丁基甲醚作溶剂时,4号2-萘胺和7号对氯苯胺与其异构体无法分离、3号对氯邻甲苯胺不出峰。因此,前处理方法中用叔丁基甲醚定容之后,需用水/甲醇(9/1,v/v)大比例稀释定容,以消除溶剂效应,减少基体干扰。

2.3 38种芳香胺的色谱分离

24种禁用芳香胺及其14种同分异构体的分离色谱图如图2所示。采用本方法可以将24种禁用芳香胺与其常见异构体一次性分离开来,表1中18号、19号和21号芳香胺与其同分异构体没有完全分离,但仍可以满足定性需要。部分芳香胺的保留时间接近,但因其质量数不同,高分辨质谱仍可通过提取一级质谱的精确质量数对其进行准确定性。整个分离可在15 min之内完成,与GC-MS和HPLC相比,仅为其检测周期的1/2。

图2 禁用芳香胺及其同分异构体的色谱分离情况 Fig.2 Chromatograms of banned aromatic amines and their isomers
2.4 线性关系及检出限

采用Orbitrap高分辨质谱对38种芳香胺进行定量分析,根据各化合物的响应情况,将38种芳香胺的标准溶液用水/甲醇(9/1,v/v)稀释成合适浓度的系列标准工作液,以其质量浓度和峰面积绘制标准曲线。因高分辨质谱提取精确质量数,基线噪声低,以S/N计算的检出限和定量限与方法的真实性能可能存在差距,因此本实验用空白基质提取液逐级稀释标准溶液至仪器所能检出的最低浓度,换算为方法的检出限[16],结果如表4所示。

表4 禁用芳香胺及其异构体的线性范围、相关系数(R2)和检出限 Table 4 Linear ranges,correlation coefficients (R2) and LODs of the banned aromatic amines and their isomers
2.5 实际样品的检测

采用本文方法检测了多个实际阳性样品。与GC-MS检测、HPLC确证的常规方法相比,本文利用一种检测仪器、一次检测即可同时分离24种禁用芳香胺及其同分异构体,并能准确定性定量,方法快速有效。

图3a、c、e分别是含有对氯苯胺、邻甲苯胺和2,6-二氨基甲苯的阳性样品及其同分异构体的标准溶液在GC-MS上的检测结果。图3a中样品的色谱峰与标准的对氯苯胺和间氯苯胺有重合,但对氯苯胺与间氯苯胺在GC-MS上无法完全分离;图3c中邻甲苯胺与间甲苯胺无法分离,从样品与标准的GC-MS色谱图对照中无法判别检出物是邻甲苯胺还是间甲苯胺;图3e中2,6-二氨基甲苯与2,4-二氨基甲苯无法完全分离。因此,单独采用GC-MS无法准确定性,常规检测还需要采用HPLC进一步确证。而采用本方法可以一次性完成上述物质的完全分离,如图3b、d、f所示,样品与标准的对照色谱图清晰地显示了结果,无需再用其他仪器确证。样品的检出结果见表5。

图3 阳性样品在(a,c,e) GC-MS和(b,d,f) UPLC-LTQ/Orbitrap的检出结果 Fig.3 Chromatograms of the positive samples on (a,c,e) GC-MS and (b,d,f) UPLC-LTQ/Orbitrap

表5 阳性纺织样品的检测结果 Table 5 Results of positive textile samples
3 结论

本文建立的应用UPLC-LTQ/Orbitrap同时筛选38种芳香胺的方法实现了采用一种方法同时对24种禁用芳香胺及其异构体的定性定量,相比日常检测中GC-MS和HPLC结合的方法,该方法快速有效,可以避免更换仪器带来的检测周期延长,实际样品检测也验证了方法的灵敏性和准确性。

参考文献
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