色谱  2014, Vol. 32 Issue (7): 675-681   PDF (827 KB)    
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李瑞萍
袁琴
黄应平
硅胶色谱柱的亲水作用保留机理及其影响因素
李瑞萍1,2, 袁琴1, 黄应平1,2     
1. 三峡库区生态环境教育部工程研究中心, 三峡大学, 湖北 宜昌 443002;
2. 三峡地区地质灾害与生态环境湖北省协同创新中心, 湖北 宜昌 443002
收稿日期：2014-4-29
基金项目：国家自然科学基金项目（20977058）；国家水体污染控制与治理科技重大专项（2012Zxo7104-002-02）.
通讯作者：黄应平，E-mail：chem_ctgu@126.com.
摘要：亲水作用色谱（HILIC）是替代反相色谱（RPLC）分离强极性及亲水性化合物的另一色谱模式，其分离机理与RPLC有很大不同，具有和RPLC互补的选择性。在HILIC模式中，采用正相色谱（NPLC）中的极性固定相及含高浓度有机溶剂（通常为乙腈）的水溶液为流动相。硅胶是开发最早、研究最为深入及应用最为广泛的HILIC固定相，本文介绍了硅胶色谱柱的HILIC保留机理，详细概述了操作条件如硅胶柱类型、流动相组成及柱温对HILIC分离的影响，并对硅胶填料色谱柱的HILIC模式的发展方向与应用前景进行了展望。
关键词： 亲水作用色谱     保留机理     硅胶柱     流动相组成     柱温    
Hydrophilic interaction chromatography on silica column：retention mechanism and its influential factors
LI Ruiping1,2, YUAN Qin1, HUANG Yingping1,2     
1. Engineering Research Center of Eco-environment in Three Gorges Reservoir Region, Ministry of Education, China Three Gorges University, Yichang 443002, China;
2. Collaborative Innovation Center for Geo-Hazards and Eco-Environment in Three Gorges Area, Yichang 443002, China
Received: 2014-4-29
Abstract: Hydrophilic interaction chromatography (HILIC) is a valuable alternative to reversed phase liquid chromatography (RPLC) for the analysis of highly polar and hydrophilic compounds, in which the separation mechanism is quite different from RPLC and the separation selectivity is complementary to RPLC. This separation mode can be characterized as normal phase liquid chromatography (NPLC) on polar columns in aqueous-organic mobile phases rich in organic solvents (usually acetonitrile). Silica has been the earliest developed and most widely used HILIC stationary phase. This review deals with the recent advances in the development of the retention mechanism on silica column with special attention to the effects of stationary phase, mobile phase composition and temperature on separation in HILIC mode. Moreover, the developing trends and applications of this HILIC mode are presented.
Key words: hydrophilic interaction chromatography (HILIC)     retention mechanism     silica column     mobile phase composition     column temperature    

亲水作用色谱(hydrophilic interaction chromatography,HILIC)于1990年由Alpert命名[1],是以亲水固定相及含有60%以上非质子有机溶剂(通常为乙腈)的水(至少2.5% )为流动相的色谱模式,为近年来色谱领域研究的热点之一[2,3,4]。HILIC是取代正相色谱(NPLC)分离极性化合物的另一色谱模式[5],与NPLC相比具有如下优点[5,6,7,8]:其一使用与反相色谱(RPLC)相似的仪器和流动相,与质谱(MS)检测器特别是电喷雾离子化质谱(ESI-MS)兼容,提高了检测灵敏度[6,7,8];其二HILIC采用水及与水互溶的有机溶剂为流动相,不仅解决了NPLC重现性差[9]及极性物质不溶于流动相的问题,同时克服了NPLC流动相与大多数RPLC洗脱剂不兼容,使得二维(2D)分离难以实施的缺点[5,10]。HILIC也是RPLC的补充,对极性化合物有合适的保留及选择性。由于采用低黏度的高比例有机相流动相,HILIC对强极性化合物分离时具有比RPLC更好的分离性能(更低的理论塔板高度)[11,12],而且与蛋白沉淀及固相萃取净化提取后的洗脱溶剂兼容,样品可以直接进样分析[13,14],实现了高通量快速分析,并提高了分析物的回收率,使样品的检出限更低。鉴于以上优点,HILIC在生物分析中使用非常广泛,近期在超高效液相色谱(UHPLC)中的应用也日益增多[15,16,17,18,19]。

最近几年,HILIC研究发展迅速,其应用领域及分析物种类不断拓展,相关HILIC研究和应用综述逐渐增多[3, 4, 5, 6, 11, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35]。其中,HILIC的固定相也受到广大学者及色谱柱生产厂家的极大关注,有很多新的固定相已商品化,目前用于HILIC模式分离的固定相已达50多种,而且这个数字仍在不断增长[4, 5, 21, 35]。在众多固定相中,未键合硅胶作为第一代HILIC固定相应用最广,尤其是以硅胶为色谱柱的HILIC与MS联用作为生物基质中极性分子分析的重要技术已经得到认可[5, 22, 30]。硅胶柱引起关注的另一原因是没有配体,不会因为配体流失而在质谱图中出现多余的峰,而且由于其稳定性高,可以在更宽的pH范围内使用[14,36]。此外,美国EPA 1694方法中,采用以未键合硅胶为色谱柱的HILIC-MS/MS方法测定环境样品中的药物及个人护理品(PPCPs)[37,38],这意味着伴随着HILIC应用研究的深入开展,HILIC技术也日益趋向稳定和标准化[26]。硅胶柱广泛用于分离极性小分子如药物,而用于糖、肽或蛋白质分离较少。本文总结了以未键合硅胶为色谱柱的HILIC保留机理,概述了操作条件如硅胶柱类型、流动相组成及柱温对极性化合物保留的影响。

1 以未键合硅胶为色谱柱的HILIC保留机理

硅胶在色谱技术中应用最广,其在效率、硬度及性能方面均优于其他填料[35]。硅胶填料分为A、B及C 3种类型[4, 31, 39]。A型硅胶为最早的通用型色谱填料,通常被金属污染,不适用于HILIC; B型硅胶为球形颗粒,金属杂质含量低,在中性到高pH(至少pH 9)范围内相对稳定;C型硅胶为“氢化硅胶”,与经典的硅胶在化学结构方面有很大不同,经典硅胶表面主要为极性硅醇基(Si-OH),而C型硅胶表面主要为硅-氢(Si-H)基团,用“含水正相”(aqueous normal phase,ANP)描述在此类硅胶相上的分离,与“经典的”HILIC分离区别,然而ANP通常被认为是替代HILIC的另一名词[40]。C型硅胶极性较低,对水的吸附少,不仅改善了保留的重现性,而且为HILIC中弱极性化合物的分离提供了新的选择性[5, 9, 41]。除了这些最初主要用于非水流动相中的硅胶外,其他专门用于水-有机流动相的硅胶材料具有较少的表面硅醇基,如Atlantis HILIC Silica,是当前HILIC应用中最常用的固定相[5, 37, 38, 42, 43, 44, 45, 46]。也有核-壳表面多孔颗粒(Halo)[47]及未衍生的亚乙基桥杂化(BEH)颗粒[48,49,50]用于HILIC分离的报道。商品化的硅胶填料在纯度上有所不同,取决于制备技术。因此,不同厂家的硅胶柱在保留性能、柱效及峰形上有很大差异,但具有相似的选择性[5,13]。

硅胶表面含有Si-OH和硅氧烷(Si-O-Si)两种基团。Si-OH为强吸附点,而Si-O-Si具有疏水性[5]。尽管HILIC概念于1990年提出,但早在20世纪80年代,这种以未键合硅胶为色谱柱,采用反相流动相的色谱模式已用于碱性化合物的分离,并提出该色谱模式下碱性化合物在硅胶柱上的保留存在离子交换机理[22, 51, 52, 53]。以未键合硅胶为色谱柱的HILIC中分析物保留主要受两种作用控制,(1)固定相表面富水层与疏水性更强的流动相之间的分配作用,(2)与固定相上薄层水之间的氢键作用。最近McCalley及Neue[54]采用高乙腈含量流动相,通过测定苯及甲苯的保留时间,证实了硅胶表面富水层的存在。HILIC的分离机理仍存在着争议,目前普遍认为,在水-有机流动相中,溶质在硅胶柱上的HILIC保留机理较复杂,包括分配作用、离子交换、氢键作用和静电作用,甚至包括在低有机溶剂浓度时与Si-O-Si疏水作用的反相保留。后来一些学者也证实了HILIC模式下碱性化合物在硅胶柱上的复杂保留机理[36, 55, 56]。总的来说,HILIC保留机理主要取决于分析物的性质、流动相组成及色谱柱特性[47,55],这种复杂机理会导致相同固定相对不同溶质的保留表现出较大差异[57,58]。

当前,HILIC保留机理仍是色谱界的研究热点。一些作者通过考察不同性质化合物在不同HILIC色谱柱上的保留行为,进一步揭示及确证HILIC保留机理。如McCalley[59]考察了中性、强酸性及强碱性化合物在硅胶、酰胺柱、二醇基柱及两性离子柱上的保留行为,实验数据证实HILIC机理非常复杂,包括分配、吸附、离子作用及疏水作用。当水含量较高时,对于大多数极性溶质常观察到logk与水相体积分数之间呈线性关系,但Jin及其合作者[60]考察了核苷在6种不同极性固定相包括3种硅胶柱(Atlantis HILIC silica,Venusil HILIC及BEH HILIC)及3种合成固定相上保留随流动相中水含量的变化,腺苷无论用分配模型还是吸附模型在6根色谱柱上都不存在线性关系。他们提出了HILIC中描述极性溶质保留行为的新方程式:

lnk=a+blnCB+cCB

式中CB为流动相中水相体积分数。常数a与溶质的分子体积相关,b与溶质-固定相作用有关,c与溶质及溶剂之间作用能有关。该模型说明了HILIC中溶质保留是一个复杂工程,不完全是受一种机理控制(如分配或吸附),以哪一种机理为主则取决于溶质的性质、极性固定相性质及流动相组成。
2 影响HILIC保留的主要因素

HILIC保留行为受到多种参数的影响,除了固定相的化学性质外,HILIC中其他实验参数(如有机溶剂、流动相pH、盐浓度及柱温)对极性化合物的保留及选择性有很大影响[5, 20, 55]。由于HILIC分离中极性化合物在一些流动相pH下带电荷,所以静电作用在HILIC中对保留起着重要作用,静电作用可以通过流动相pH及盐浓度调节。最近,有作者通过测定不同性质化合物(包括酸性、碱性及中性)在不同HILIC柱上的保留数据,以确定哪个实验参数是影响HILIC分离中选择性的最重要因素[55]。本文重点总结以硅胶为色谱柱的HILIC中影响溶质保留及分离选择性的主要因素,包括硅胶柱、有机溶剂、缓冲溶液及柱温。

2.1 硅胶柱

未键合硅胶仍然是HILIC中广泛使用的固定相,尤其是在生物分析领域[2, 3, 4, 19, 30]。由于HILIC流动相中水相含量较高[36],在NPLC中硅胶色谱柱所引起的溶质不可逆吸附及保留重现性差等问题在HILIC中并不是难题[61]。许多色谱柱生产厂家研发制备出专门用于HILIC的硅胶柱,如Atlantis HILIC,Zorbax HILIC plus及YMC pack silica色谱柱等。用于HILIC的硅胶柱使用水/有机溶剂(如水及乙腈)填充及储存,而不是正相溶剂。研究发现,不同的A型硅胶柱性能存在较大差异,这可能是因为A型硅胶纯度低,金属杂质的含量不同且含量较高[62];而B型硅胶柱的色谱性能相似,如McCalley比较了几种不同酸性、碱性及中性化合物在3种不同B型硅胶柱上的分离情况,发现所考察化合物在3种色谱柱上的保留时间及分离选择性均相似[59]。此外,Heaton及其合作者还发现B型硅胶与C型硅胶也具有非常相似的保留选择性[40]。

亚乙基桥杂化(BEH)硅胶中约三分之一的表面Si-OH被除去,因此减弱了与Si-OH作用的化合物的保留,由于乙基桥链的嵌入使得BEH颗粒表面pKa及残留表面Si-OH的带电状态与经典的硅胶表面不同,影响了其保留性能[48,49,50]。Grumbach等[48]比较了1.7 μ m的BEH颗粒与3 μ m未衍生硅胶填料的保留特性,发现在pH 5时,未衍生的BEH颗粒具有更好的耐化学腐蚀性,其ESI-MS灵敏度比3 μ m硅胶高2.2～4.7倍。BEH颗粒优越的化学及机械稳定性在HPLC及UPLC中非常有用,可以允许HILIC方法开发中使用极限pH[48]。此外,根据核-壳技术制备的薄壳型多孔硅胶柱已用于HILIC分离,由于使用低黏度溶剂,故柱反压低而柱效高,采用长柱(如45 cm)分离酸性及碱性溶质的柱效率超过105塔板数,短柱的柱效比亚-2 μ m反相色谱填料的更高,并且已被证实在硅胶基质反相色谱柱上超载的离子型碱性化合物在该色谱柱上不易超载[63]。

2.2 有机溶剂
2.2.1 有机溶剂类型

在大多数HILIC应用中,乙腈是优先使用的有机溶剂,其他溶剂如甲醇等常使样品不能足够保留及产生宽峰或不对称峰[18, 57, 58, 64],因而在HILIC中很少使用。甲醇在HILIC中的性能差可能因为其与水相似,都是质子溶剂,与水竞争使硅胶表面溶剂化,彼此发生强的氢键作用,其他醇如乙醇及异丙醇等在较小程度上也可发生氢键作用。乙腈没有质子给予作用,因此采用乙腈时在极性固定相表面形成的水层与甲醇等有很大不同。有报道尝试[18,57]采用低毒性的溶剂如乙醇或异丙醇代替乙腈,但至今为止仍不成功。

丙酮与乙腈极性相似,在HILIC条件下对溶质显示较弱保留及不同的选择性[65],然而丙酮在UV区有吸收,使得MS信号强度低,因此并不推荐采用丙酮代替乙腈[64]。在乙腈-水及乙醇-水流动相中加入二氧化碳会影响核酸碱基、皮质醇、氟联苯丙酸、茶碱及咖啡因在硅胶柱上的保留及分离选择性,当乙醇-水流动相中含有高浓度的二氧化碳时,所考察溶质的分离与在乙腈-水流动相中相似[66]。乙醇具有与乙腈相同的洗脱强度,但价格低很多,其产量巨大,并能被生物降解,所以是一个很有前途的取代溶剂[67,68]。

随着HILIC技术的发展,也有将三元溶剂用于硅胶色谱柱的HILIC分离的报道。在三元流动相的HILIC系统中,可以通过改变两种有机溶剂的浓度来调整溶质的保留,但这种三元溶剂在HILIC中使用较少[2,65]。HILIC模式中有机溶剂的选择性强烈地影响保留,有机溶剂的洗脱强度一般随着溶剂极性及给予质子/接受质子能力的增大而增强,但溶剂的选择性有很大差异。这主要是因为溶剂的选择性受溶剂强度、溶剂-溶质的定域化作用及溶剂-溶质之间的氢键作用影响[57, 58, 64]。

2.2.2 有机溶剂浓度

与非水相的NPLC相似,HILIC模式中溶质的保留随其极性增大而增强。当固定相确定后,流动相中有机溶剂含量是控制分离的主要因素,随着流动相中有机溶剂(如乙腈)含量的增大,极性化合物在固定相上的保留增强[20,64]。当流动相中有机溶剂含量改变时,可导致分离选择性的改变甚至洗脱顺序的改变,或分析物的MS/MS检测灵敏度变化[69]。

最近,Gritti等[70]以水-乙腈混合物为流动相,采用前沿分析法(FA)测定了吡啶在Halo柱上的等温线,结果发现在乙腈含量低的富水液相色谱(per aqueous liquid chromatography,PALC)及乙腈含量高的HILIC中存在两种不同的保留机理;在PALC模式中,吡啶在硅胶表面的吸附机理受非常少的极活泼吸附位点的疏水作用控制;而在HILIC模式中,吸附行为较均匀,吡啶保留受自由Si-OH的吸附作用控制。该课题组以咖啡因为模型化合物,在Halo柱上得到了相同的结论[71]。对于中间的流动相组成,Si-O-Si及Si-OH分别被乙腈及水充分饱和,使得吡啶在Halo柱上的保留因子最小(即呈U形)[70]。在此之前,也有作者发现随着流动相中有机溶剂含量的改变一些溶质在硅胶柱上的保留呈这种U形模式,如氨基酸[68]、表阿霉素及其类似物[72]、苯及甲苯[54]等。

近来有研究报道,采用极性有机溶剂取代富乙腈流动相中的水,将该技术称为“非水HILIC” (NA-HILIC)[73]。由于流动相中不含水,吸附在固定相上的液相扩散层为有机“质子改性剂”,如乙烯二醇、甲醇或乙醇(洗脱强度依次降低),这些洗脱条件有时被称为“有机极性模式”,对色谱选择性有很大影响,弥补了“非水NPLC”及“水-有机HILIC”之间的缺口。NA-HILIC有助于分析低聚物或弱极性化合物,这些物质可能在含水的HILIC流动相中沉淀。

2.3 缓冲溶液

在HILIC分离过程中,弱酸或弱碱可以以离子或非离子型体存在,溶质以混合型体存在导致峰展宽、不规则峰,甚至分裂峰。在RPLC中,由于离子型体保留弱,离解通常被抑制。HILIC流动相常含有缓冲液,通过控制缓冲液的pH值及离子强度来调节离子型样品的保留及分离选择性[74]。与RPLC相反,通过选择缓冲液pH值增大溶质的电离度(对于酸,pH＞7;对于碱,pH＜7),从而达到调整其保留时间的目的。

拖尾峰在HILIC中比在RPLC操作中更常见,因为HILIC柱更易超载,峰形有时可通过增大流动相离子强度得以改善[40]。在流动相中加入三氟乙酸(TFA)通过形成离子缔合体可以改善碱性化合物在硅胶柱上的峰形。无论是高缓冲液浓度还是TFA,在HILIC/MS应用中均不推荐使用,因为它们抑制电喷雾离子化[75],在实际操作中优先使用甲酸。

2.3.1 缓冲液pH

流动相pH是非常重要的色谱参数,其影响固定相及极性溶质的电荷状态。带电荷溶质比其中性型体亲水性更强,因此在HILIC中保留更强。对于硅胶柱,由于Si-OH的离子化,其电荷状态也取决于流动相pH。当pH较高时(pH＞4～5),表面Si-OH去质子化,硅胶带负电[55]。硅胶柱表面电荷的这种变化对带电溶质的保留产生很大影响,如我们发现当缓冲液pH从2.4增大到6.5时,蒽环类碱性药物在硅胶柱上的保留出现先增强后减弱的现象[57]。Liu等[76]发现随着缓冲液pH (2.5～5.0)的增大,氨甲基吡啶异构体在硅胶柱上的保留增强,而其降解产物的保留减弱,是因为多种作用(氢键及离子交换等)控制保留所致。此外有报道称,随着缓冲液pH值的增大,碱性化合物的保留时间缩短,分离变差[58];中性化合物(如尿苷酸及脱氧尿苷酸)的保留略增强[55],可能因为随着pH的升高,Si-OH的离子化程度增大,使得硅胶表面的水层增厚,导致这些中性化合物的保留增强。

2.3.2 缓冲液类型

HILIC中带电荷的极性固定相可以与带电荷的溶质发生显著的静电作用,反过来对其保留及选择性有很大影响,流动相中不加缓冲液会导致拖尾峰或宽峰[36, 40, 77]。由于流动相中有机溶剂含量高,需要采用能在高含量有机溶剂(如乙腈)中有足够溶解度的盐(如甲酸盐及乙酸盐等),这些盐的另外一个优点是它们可挥发,与ESI-MS检测器兼容[40]。

不同的缓冲盐对相同溶质的保留有很大不同,如土霉素在以甲酸盐、磷酸盐及草酸盐为缓冲液时在硅胶柱上的保留[77],以及芳香胺类化合物在草酸盐及磷酸盐为缓冲液时的保留等[58],但使用乙酸盐及甲酸盐时乙酰水杨酸及胞嘧啶在硅胶柱上的保留没有差异,而使用碳酸氢铵时乙酰水杨酸的保留显著降低,但胞嘧啶的保留受影响较小[78]。一些溶质当采用不同缓冲液时在硅胶柱上的保留没差异,但在薄壳型多孔硅胶柱上有显著差异[79]。缓冲液的类型对酸性及碱性溶质的分离选择性有很大影响,如酸性溶质在甲酸铵缓冲液中保留弱,或呈现排斥;碱性溶质在甲酸铵缓冲液中的峰形好[36]。缓冲液的pH及离子强度也会影响溶质峰形,因为它们影响了亲水作用及离子作用对保留的相对贡献[40]。

2.3.3 缓冲液浓度

缓冲液浓度对选择性的影响较小,但可有效地减小带电荷溶质与固定相之间的静电作用(包括吸引及排斥),随着盐浓度的增大,对带正电荷溶质的保留减弱,而对带负电荷溶质的保留增大[36, 55, 80]。此外,缓冲液浓度影响离子型溶质尤其是碱性化合物在硅胶柱上的峰形[40]。

盐浓度除了调节带电溶质与固定相之间的静电作用外,还发现对不存在静电作用的溶质保留也产生影响,如Guo等[78]研究发现,当乙酸铵的浓度增大时,胞嘧啶在硅胶固定相上的保留略增强,而胞嘧啶在实验条件下不带电荷,硅胶固定相带负电荷。有人提出更高的盐浓度可能增大了固定相表面富水层体积,进而使保留增强[55,81]。尽管该假设与亲水分配模型相符,但没有直接的实验证据证明盐浓度增大对富水层产生影响。

Guo等[81]采用一种实验设计(DOE)方法研究了多种色谱条件(如乙腈含量、柱温及盐浓度)对极性化合物在不同固定相上保留的影响。响应面分析证实在所考察的乙腈浓度及柱温范围内,盐浓度对保留的影响并不恒定。盐浓度在较高乙腈浓度及较低柱温时对保留的影响更大,而且DOE研究结果也证明了色谱条件(如乙腈含量、柱温及盐浓度)的相对重要性。最近Kumar等[55]通过实验也得出了类似结论。

盐浓度的影响考察大多在固定柱温及流动相中有机溶剂含量的情况下进行,使得盐浓度为唯一变量,这些研究并未提供盐浓度与其他色谱条件如有机溶剂含量及柱温之间的关系[64]。

2.4 温度

在HILIC中,温度不仅影响流动相黏度及溶质的扩散系数,而且影响溶质在流动相与固定相之间的焓变( Δ H),因此柱温对溶质保留有很大影响。溶质保留与柱温之间的关系可以用van’t Hoff曲线描述,从van’t Hoff曲线的线性或非线性可知保留机理在所考察温度范围内是否发生改变或是否有多种作用控制保留[82]。

Hao等[74]报道了6种氨基酸类化合物在Atlantis硅胶柱上的van’t Hoff曲线图,其中3种化合物(甘氨酸及其二、三肽)的van’t Hoff曲线图呈现很好的线性,而它们的3种葡萄糖衍生物的van’t Hoff曲线图则呈弯曲状。所有化合物在实验条件下均带正电荷,van’t Hoff曲线出现弯曲不能简单地解释为与去质子化表面Si-OH的静电作用,因为甘氨酸及其二、三肽与它们的葡萄糖衍生物的静电作用相似,但前者没有出现弯曲。后者的van’t Hoff曲线出现弯曲是由于存在的葡萄糖部分产生氢键作用所致。Dong及Huang[72]研究了温度对极性药物分子在高纯硅胶柱中保留行为的影响,发现在HILIC模式下,温度对溶质保留的影响与流动相中有机溶剂的类型、离子强度及pH值密切相关,通过对色谱保留机理的探讨,证明保留机理的多重性导致了不同流动相中溶质保留对温度出现不同的响应结果。

大多数HILIC系统中温度的影响用van’t Hoff曲线描述是合适的,然而也有一些HILIC系统,当温度升高时保留值增大,或更多的是保留与温度无关[78];更重要的是,峰宽随着温度的升高变得更窄,柱效提高[72,74]。温度对相同溶质在A型及B型硅胶柱上保留行为的影响相反,如6种氨基酸类化合物在A型硅胶柱上的van’t Hoff曲线斜率均为负值,但在B型硅胶上的van’t Hoff曲线斜率均为正值[74]。HILIC中溶质保留通常随温度升高而降低,是因为减小了结合能、流动相及固定相之间的氢键作用及其他极性作用[81],但是温度改变对保留的影响比流动相组成的影响小[55,81]。对于分子大小或形状及氢键碱性不同的化合物,尤其是部分可离解的溶质,温度对其分离选择性影响较大[5,83]。在经典HPLC中采用高温色谱,可以获得高柱效及快速分析,避免了采用长柱时高反压的产生[84]。

3 结论与展望

硅胶是HILIC分离中使用最多的固定相,尤其是近几年来,由于亚-2 μ m小粒径硅胶、核-壳型硅胶、有机杂化硅胶等新型硅胶的出现,使得以硅胶为色谱柱的HILIC分离技术获得了飞速发展,进一步扩大这些新型固定相在HILIC分离中的实际应用将是一个重要的研究热点。

目前基于硅胶色谱柱的HILIC分离机理仍存有争议,但其混合保留机理已得到认可。HILIC体系的机理比RPLC或非水的NPLC体系更复杂,一些特殊结构样品的分离与流动相有很大关系。离子型样品的分离可通过添加盐、弱酸或碱等改善分离。不同的样品分子在亚-2 μ m小粒径硅胶、核-壳型硅胶、有机杂化硅胶等新型硅胶中的保留机理研究将是一个重要的研究方向。

影响HILIC分离的因素较多,通过优化多个色谱参数,可以实现目标组分和基体干扰物质的分离。乙腈是HILIC中常用的流动相有机组分,采用其他的极性有机溶剂取代乙腈的尝试至今不成功,HILIC通往“绿色”流动相还需要很长一段历程。采用非水流动相的“有机极性模式”分离系统(即非水HILIC)由乙腈及作为极性溶剂的醇组成,使得HILIC应用扩大到极性较弱的样品。

总的来说,HILIC已经是HPLC技术中不可缺少的分离技术之一。我们期望新的HILIC填料不断出现,用于各种各样的极性样品分离,而且能在一次运行中同时分离强极性和弱极性组分。此外,尽管美国EPA 1694方法将HILIC作为标准分析方法用于测定环境样品中的PPCPs,但要成为实验室的常规方法还需要做大量工作。

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