杂环胺(heterocyclic amines,HAs)是畜禽、鱼肉等富含蛋白质的食品在烧烤、油炸等高温过程中生成的具有一个或多个氮原子的多环芳香族化合物。污染物致突变性检测及长期的动物试验研究均表明,HAs具有强烈的致突变性和致癌性[1, 2]。至今,已经在各种煎炸食品中先后发现超过30种HAs类化合物,主要包括喹啉类、喹喔啉类、吡啶类、呋喃吡啶类和氨基咔啉类等五大类化合物[3, 4](见表1)。它们在烧烤食品[5, 6]、煎炸食品[7, 8]、奶酪[9, 10]等食品中居多,在卷烟烟气[11, 12]、大气环境[13]、尿样[14, 15, 16, 17]、毛发[18]等样品中也可以检测到。
由于烧烤和油炸食品的基质复杂、基体干扰严重,且HAs在样品中含量水平很低(以ng/g计)[19],因此高效、高选择性的样品前处理方法和灵敏的分析手段是痕量杂环胺分析的关键。目前,HAs分析时常用溶剂萃取、固相萃取、串联固相萃取和固相微萃取等样品前处理方法以及液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法等分析检测方法。
样品前处理是指对样品采用合适的分解和溶解方法以及对待测组分进行提取、净化和浓缩的过程,使被测组分转变成可测定的形式,从而进行定性和定量分析。由于烧烤、煎炸类食品通常含有大量的油脂、蛋白质等物质,基体复杂、HAs含量低至ng/g水平,因此需要高效、高选择性的样品前处理技术。
目前HAs分析检测时常用的样品前处理方法主要有溶剂萃取、固相萃取和固相微萃取等。
溶剂萃取法是最经典的样品前处理方法。由于HAs是一类有机弱碱性化合物,它们在碱性条件下易溶于有机溶剂,而在酸性条件下易溶于水,因此在采用溶剂萃取法分离富集时常结合其溶解性能进行研究。一般采用水、盐酸、氢氧化钠溶液等无机溶剂或/和甲醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷和混合醇等有机溶剂萃取。Janoszka等[20]将烤肉样品用盐酸处理后,用二氯甲烷萃取其中的IQ、MeIQ、MeIQx、4,8-DiMeIQx和PhIP;而Sun等[21]用氢氧化钠溶液-甲醇萃取烤肉中的Nor-Harman、Harman、DMIP、PhIP和A α C,并结合固相萃取对萃取液进行净化处理。如果分析样品是酒水等简单基体时,也可直接用液液萃取法,如王敏等[22]采用氢氧化钠溶液-乙酸乙酯萃取葡萄酒中的14种HAs,萃取液直接用于液相色谱-离子阱-飞行时间串联质谱分析。
由于溶剂萃取法的选择性较差,同时萃取液中通常含有大量的油脂和蛋白质等干扰物,难以直接分析检测,因此在实际使用时,溶剂萃取法通常与其他前处理方法结合使用。固相萃取(solid-phase extraction,SPE)是目前HAs分析中较常用的一种样品净化方法,一般根据分析对象的结构和性质选择合适的吸附剂,其中硅藻土、人造丝、蓝棉、PRS(propylsulfonic acid silica)、C18、SCX(强阳离子交换)、CBA、MCX(混合型阳离子交换固相萃取吸附剂)和Lichrolut EN(树脂型吸附剂)等吸附剂广泛应用于HAs分析中[3, 23, 24, 25]。此外,在固相萃取时,还需要考虑合适的洗脱溶剂才能获得较佳的效果。郭海涛等[26]以NaOH溶液和二氯甲烷为溶剂结合超声波辅助萃取油炸样品和羊肉中的HAs,萃取液经MCX柱净化富集后,采用HPLC分析检测了样品中的IQ等9种常见HAs。张峰等[27]也采用碱性甲醇溶剂结合超声波辅助萃取了烤鱼中的15种HAs,萃取液经Lichrolut EN柱净化并用超高效液相色谱-电喷雾串联质谱(UPLC-ESI-MS/MS)进行分析。当采用单一固相萃取柱净化时,如果其净化效果不佳,可结合不同吸附剂进行多级净化。如Ozdestan等[28]在分析烤肉丸中MeIQx、4,8-DiMeIQx、PhIP、Nor-Harman和Harman时,将样品用0.2 mol/L 盐酸处理,样品溶液经去除蛋白并采用C18 SPE柱净化,然后再用MCX SPE小柱进一步净化;Oz等[29]先将冻肉用NaOH溶液萃取,然后分别用硅藻土和MCX柱净化富集,结合液相色谱分析了样品中的IQ、MeIQ、MeIQx、4,8-DiMeIQ、7,8-DiMeIQx、PhIP、A α C和MeA α C 8种HAs。这种采用多次固相萃取的方式能够提高分析物的净化效果,但这种多步净化方式操作繁琐费时、容易造成样品损失[30]。
当样品基体较为复杂时,可将多级固相萃取进行串联,以此减少样品转移、浓缩等步骤,节省时间并减少样品损失,提高分析方法的灵敏度和选择性。Gross和Grüter[31]将Extrelut硅藻土柱与PRS强阳离子交换柱直接串联,建立了煎炸、烘烤鲑鱼中一系列极性和非极性HAs的串联固相萃取方法。该方法对多数HAs的净化效果很好,但它对更高温度下产生的PhIP的富集和净化效果较差,回收率较低。通过调整SPE的上样溶剂、洗脱剂及吸附剂种类,可以改进和拓展串联固相萃取方法的应用范围[10, 28, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42]。Toribio等[37]将PRS柱和C18柱串联,并调整上样溶剂和洗脱溶剂,建立的串联固相萃取法对牛肉中PhIP等14种HAs均可得到满意的分离富集效果。Zhang等[39]同样采用PRS柱和C18柱串联方法,通过优化pH、洗脱溶剂及其体积,结合LC-ESI-MS/MS分析了烤排骨、烤猪肚、烤鸡翅膀和酱牛肉中的IQ、MeIQ、MeIQx、4,8-DiMeIQx、PhIP和TriMeIQx。
与液液萃取和固相萃取相比,固相微萃取(solid-phase microextraction,SPME)集采样、萃取、浓缩和进样于一体,具有操作时间短、样品量需求小等优点,特别适用于挥发性与非挥发性物质的分离分析。Cardenes等[43]建立了烤肉中IQ、MeIQ、MeIQx、Nor-Harman、Harman、Trp-P-2、Trp-P-1、A α C和MeA α C 9种HAs的SPME-HPLC分析方法。他们将样品用氢氧化钠溶液-甲醇萃取,研究了SPME中吸附和解吸时间、离子强度等因素的影响,并对比了CW-TPR、CW-DVB、PDMS-DVB和PA 4种商品涂层对HAs的富集效果。实验表明CW-TPR适合分析IQ、MeIQ、MeIQx、Harman、Trp-P-2、Trp-P-1、A α C和MeA α C,但该方法对Nor-Harman的富集效果较差,且涂层存在较强的记忆效应。随后,该课题组[44]用离子液体1-hexyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate作为解吸溶剂,能较好地消除CW-TPR涂层的记忆效应并降低有机溶剂使用量,实现了猪肉中Harman、Nor-Harman、Trp-P-2、Trp-P-1、A α C和MeA α C的高效富集。因样品复杂,商品化涂层的选择性不高,从而限制了SPME方法在HAs分析中的应用,因此具有选择性甚至特异性的SPME涂层,如分子印迹涂层等,具有较好的应用潜力。
微波辅助萃取(microwave-assisted extraction,MAE)通过微波作用强化样品处理中的传热和传质过程,加快样品处理速度、提高样品处理效率。Agudelo Mesa等[6]发展了一种HAs的微波辅助萃取/分散液液微萃取分离方法。他们以正庚烷为萃取溶剂,采用微波辅助萃取烤牛排中的Trp-P-1、Trp-P-2、PhIP、A α C、MeA α C和DMIP,然后用离子液体1-辛基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(1-octyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate)作分散液液微萃取材料进行富集。该方法的富集倍数可达到19～30倍。在使用MAE处理肉制品时,要严格控制微波温度,避免产生新的HAs。
HAs的分析通常采用GC、GC-MS、HPLC、LC-MS及酶联免疫吸附(ELISA)等。由于食品基体复杂、杂环胺含量极低,目前未见单一的光分析、电分析杂环胺的测定方法。大多数HAs是极性且非挥发性的,采用GC分析HAs时,需对其进行衍生化,一般采用硅烷化衍生化法和酰化衍生化法。此外,由于HAs结构中含有氮原子,采用氮磷检测器可提高HAs的检测选择性和灵敏性[45]。GC-MS在HAs分析中也有一定的应用[24]。但衍生化技术操作较繁琐、检测灵敏度不高等因素限制了GC方法在HAs分析中的应用。目前有关食品中HAs的分析主要采用LC和LC-MS方法。
HAs都具有较强的紫外吸收,因此HPLC-UV是最常采用的方法[26, 29, 34, 37, 41]。Oz等[29]建立了油炸肉丸中9种HAs的UPLC-UV分析方法,方法的检出限为0.22～4.58 ng/g,回收率为57.8% ～135% 。但由于肉制品经预处理后仍有大量的共提物,一些干扰物的紫外吸收光谱与HAs非常接近,此时采用HPLC-UV分析难以进行准确的定量。对于一些具有荧光特性的HAs,可采用HPLC-FLD提高其分析灵敏度[42, 44]。Martin-Calero等[44]采用HPLC-FLD分析了肉制品中Harman、Nor-Harman、Trp-P-2、Trp-P-1、A α C和MeA α C等6种HAs,检出限低至0.3～75 ng/L,回收率为68.5% ～118% 。采用FLD和UV协同检测有助于排除样品基体的干扰,提高分析的准确度[21, 36, 46],如Agudelo Mesa等[6]采用HPLC-FLD-DAD分析了牛排中6种HAs。另外,HAs具有电化学氧化性,分析时也可选择电化学检测器(ECD)。Martin-Calero等[47]建立了肉质食品中Trp-P-2、Trp-P-1、A α C、MeA α C、Harman和Nor-Harman的HPLC-ECD分析方法,检出限为0.165～9.30 ng/g,回收率为41% ～89% 。
目前,结合高灵敏度质谱检测器的LC-MS在食品中痕量杂环胺的分析中受到了越来越多的关注[22, 32, 48, 49, 50]。通常采用HPLC-ESI-MS分析食品中的HAs,如Messner等[32]建立了牛肉、猪肉和鸡肉烧烤样品中10种HAs的LC-ESI-MS分析方法,考察了样品中这10种HAs的形成与加热时间和加热温度的关系。Barcelo-Barrachina等[49]建立了牛肉中16种HAs的HPLC-ESI-MS分析方法,其检出限小于13 pg;同样,液相色谱-离子阱-飞行时间串联质谱法(LC-IT-TOF-MS)也适于分析食品中的HAs。王敏等[22]建立了LC-IT-TOF-MS同时测定葡萄酒中14种HAs残留量的分析方法,该法采用内标法进行定量,可满足葡萄酒中多种HAs残留同时检测的要求。此外,通过MS/MS可进一步提高检测的灵敏度[2, 39, 40]; Zhang等[39]采用HPLC-ESI-MS/MS分析烤肉中IQ、MeIQ、MeIQx、4,8-DiMeIQx、PhIP和TriMeIQx,检出限为0.1 μ g/kg,回收率在76.4% ～122.2%之间。
高效薄层色谱法(high performance thin layer chromatography,HPTLC)具有操作简单、不需要贵重的仪器设备、杂质对色谱系统的干扰小、分析成本低等优点。Jautz等[46]利用HPTLC和HPLC分析了油炸牛肉中PhIP、MeIQx、4,8-DiMelQx、Nor-Harman和Harman。HPTLC方法的分析成本低,但其准确度较HPLC方法低。
ELISA法因具有快速灵敏、高选择性等特点,适合快速筛选和现场分析,一些单克隆抗体已成功应用于食品中HAs的分析检测。 该方法的特异性高,但目前HAs的单克隆抗体较少,只有IQ、MeIQ、MeIQx、4,8-DiMeIQx和PhIP可采用ELISA分析[51]。
表2列出了典型的用于食品中杂环胺分析的样品前处理及分析方法。
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作为一类在高温烹饪过程中产生的具有较强致突变性的食品危害物质,杂环胺及其分析检测尚未纳入我国现行的食品卫生检验标准,但近年来有关食品中痕量杂环胺的分析检测及危害机制等研究已受到国内外研究者的高度关注。因不同杂环胺的物理化学性质差异大、含量很低、基体复杂，肉类食品中现有的痕量杂环胺的样品前处理技术和分析方法较少，随着发展微波场、超声场等场辅助萃取技术和高效、高选择性的新型介质，有望突破其前处理技术瓶颈；同时，可发展基于表面增强拉曼光谱和免疫分析的快检技术，以及各种样品前处理-色谱/光谱在线联用技术，将为更深入研究杂环胺的检测、形成机理、毒理等提供技术支撑。
2014, Vol. 32 Issue (9): 975-980
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