色谱  2014, Vol. 32 Issue (9): 999-1004   PDF (1638 KB)    
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超高效液相色谱-串联质谱法检测水系模拟物中11种工业用抗氧化剂
范赛1, 邹建宏2, 李丽萍1, 张楠1, 刘伟1, 李兵1, 赵旭东1, 吴国华1, 薛颖1, 赵榕1     
1. 北京市疾病预防控制中心, 营养与食品卫生所, 科研教学管理办公室, 北京 100013;
2. 中国人民解放军第二炮兵总医院, 北京 100088
收稿日期：2014-5-16
基金项目：“十二五”国家科技支撑计划项目（2011BAK10B05-04）.
通讯作者：赵榕，E-mail: lxyue@yeah.net.
摘要：建立了水系模拟物中11种工业用抗氧化剂的超高效液相色谱-串联质谱检测方法。水系模拟物经ProElut PLS固相萃取柱浓缩富集，采用ACQUITY UPLCTM BEH C18超高效液相色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）分离，水和乙腈作为流动相进行梯度洗脱，电喷雾离子源电离，负离子多反应监测模式下进行监测，外标法定量。11种化合物在5.0~100 μg/L范围内呈良好线性关系，相关系数r>0.995，方法检出限为0.2~1.0 μg/L，定量限为0.5~3.0 μg/L。5.0、10.0和20.0 μg/L添加水平下的加标回收率为61.4%~109.4%，RSD为3.9%~18.2%（n=6）。该方法操作简单、稳定、可靠，可以满足水系模拟物中11种抗氧化剂的定性确证和定量检测。
关键词： 超高效液相色谱-串联质谱     固相萃取     抗氧化剂     水系模拟物     包装材料    
Determination of 11 industrial antioxidants in the aqueous simulants by ultra-performance liquid chromatography- tandem mass spectrometry
FAN Sai1, ZOU Jianhong2, LI Liping1, ZHANG Nan1, LIU Wei1, LI Bing1, ZHAO Xudong1, WU Guohua1, XUE Ying1, ZHAO Rong1     
1. Institute of Nutrition and Food Hygiene, Beijing Center for Disease Control and Prevention, Research and Education Office, Beijing 100013, China;
2. The Second Artillery Hospital, People's Liberation Army, Beijing 100088, China
Received: 2014-5-16
Abstract: An ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method has been developed to identify and determine 11 industrial antioxidants in the aqueous simulants. A ProElut PLS SPE column was used for the enrichment, and an ACQUITY UPLCTM BEH C18 UPLC column (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm) was used for separation by the gradient elution with pure water and acetonitrile as the mobile phases. The MS/MS detection was performed with an electrospray ionization (ESI) source in negative mode. The external standard method was used for quantitation in the present study. The linear ranges of the 11 analytes were from 5.0 to 100 μg/L. The coefficients of correlation were greater than 0.995. The recoveries of blank aqueous simulants fortified with the 11 analytes at the levels of 5.0, 10.0 and 20.0 μg/L were 61.4% to 109.4% with the relative standard deviations varied from 3.9% to 18.2% (n=6). The LODs and LOQs of the 11 analytes in aqueous simulants were 0.2-1.0 μg/L and 0.5-3.0 μg/L, respectively. This method is highly sensitive and accurate, and can be applied to the determination of the 11 trace industrial antioxidants in the aqueous simulants.
Key words: ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS)     solid phase extraction (SPE)     antioxidants     aqueous simulants     packing material    

抗氧化剂(antioxidants)是可阻止氧气产生不良影响的物质,用于防止聚合物材料因氧化降解而失去强度和韧性[1]。作为食品包装材料的主要添加剂之一,抗氧化剂广泛用于塑料、纸质材料、橡胶等行业,以抑制和延缓该类材料的氧化和降解,从而延长材料的使用寿命。然而,包装材料中添加的抗氧化剂多为人工合成,相对于天然抗氧化剂,其毒性更强,在与食品接触的过程中会以渗透、迁移等形式进入食品,对消费者身体健康产生一定的影响[1, 2, 3]。因此,欧美国家和世界卫生组织等国家和机构均对食品包装材料中常见抗氧化剂的使用进行了规定,明确了相关的使用种类、原则、范围、用量等[4, 5]。如丁基羟基茴香醚(butyl hydroxy anisd,BHA)的特定迁移量(specific migration limit,SML)=30 mg/kg、抗氧化剂 245(triethylene glycol bis(3-tert-butyl-4-hydroxy-5-methylphenyl)propionate,Irganox 245)的SML=9 mg/kg、抗氧化剂 1790(tris(4-tert-butyl-3-hydroxy-2,6-dimethylbenzyl) isocyanurate,Cyanox 1790)的SML=6 mg/kg、抗氧化剂MD 1024(N,N′-bis(3-(3,5-di-tert-butyl-4-hydroxyphenyl) propion,Irganox MD 1024)的SML=15 mg/kg、抗氧化剂 2246(2,2′-methylenbis(4-methyl-6-tert-butylphenol),Ao 2246)的 SML=1.5 mg/kg。目前,国内对食品包装材料相关检测项目设置匮乏,且缺乏对应的简便、高效、准确的检测手段,使得多数食品包装材料的安全检测无法满足国外规定的标准,甚至影响到相关食品的出口。本研究通过建立一种高效、快捷、准确的检测方法,深入进行食品和食品包装材料中抗氧化剂的检测技术研究,以满足国内对相关技术手段的需求,并对监测食品中抗氧化剂的迁移情况提供技术支持。

常用于包装材料中抗氧化剂的检测方法有高效液相色谱法(HPLC)[6, 7, 8]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[8, 9]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[10, 11, 12, 13, 14, 15, 16]等。HPLC由于检测项目单一、灵敏度低等原因,近年来逐渐被高通量、高灵敏度的LC-MS/MS所取代。本文通过ProElut PLS固相萃取小柱对水系模拟物中的11种抗氧化剂进行富集净化,并结合超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)技术进行分离检测。方法准确可靠、灵敏度度高,适用于水系模拟物中11种工业用抗氧化剂的确证和定量检测。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

ACQUITYTM超高压液相色谱仪和Micromass Quattro Premier XE质谱仪(美国Waters公司),AllegraTM X-22R型离心机(美国Beckman公司),氮吹浓缩仪(美国Organomation Associates公司); ProElut PLS固相萃取小柱(6 mL,200 mg，迪马公司)。

甲醇、乙醇、乙腈和乙酸铵均为色谱纯(迪马公司);甲酸(纯度为99% ,Ameisensaeure公司);超纯水,电阻率为18.2 M Ω \5cm(Millipore公司超纯水器制备)。

标准品: BHA、抗氧化剂100(3,5-bis(1,1-dimethylethyl)-4-hydroxy-benzenemethano,Ionox 100)、Cyanox 1790、抗氧化剂 1035(3,5-bis(1,1-dimethylethyl)-4-hydroxybenzenepropanoic acid thiodi-2,1-ethanediyl ester,Irganox 1035)、Ao 2246、抗氧化剂129(phenol,2,2′-ethylidenebis[4,6-bis(1,1-dimethylethyl)-,Ionox 129)、抗氧化剂 1010(pentaerythritol tetrakys 3-(3,5-di-tert-butyl-4-hydroxyphenyl)propionate,Irganox 1010)购自美国Sigma公司;Irganox 245、2′,2-草酰胺基双-［乙基3-(3,5-二叔丁基-4-羟苯基)]丙酸酯(2,2′-oxamidobis[ethyl-3-(3,5-di-tert-butyl-4-hydroxyphenyl)propionate],Naugard XL-1)、Irganox MD 1024购自美国AccuStandard公司;抗氧剂Nonflex CBP(phenol,2,2′-methylenebis[4-methyl-6-(1-methylcyclohexyl)-,Nonflex CBP)购自日本TCI公司。标准品纯度＞95.0% 。

1.2 标准溶液的配制

准确称取(精确至0.1 mg)各种标准品置于10 mL容量瓶中,加入1 mL三氯甲烷溶解,以甲醇定容,配制各抗氧化剂质量浓度为1.000 g/L 的标准储备液,置于-20 ℃冰箱保存。使用时分别取适量的储备液用乙醇稀释并定容,配制成1.0 mg/L 的标准使用液。

1.3 水系模拟物的配制

参照国家标准GB/T 23296.1-2009,水系模拟物包括以下规格。模拟物A:蒸馏水或同等纯度的水;模拟物B: 3%乙酸水溶液(将30 g乙酸用纯水稀释至1 L);模拟物C: 10%乙醇水溶液(将100 mL乙醇用纯水稀释至1 L)。并借鉴国家标准GB/T 23296.1-2009中的极限浸泡方式(100 ℃，4 h)对塑料样品进行浸泡，以便进行后续的操作。

1.4 水系模拟物前处理

分别准确量取以上浸泡后的模拟物A、B、C溶液5 mL;模拟物A和B中分别加入5 mL乙醇,模拟物C中加入4 mL乙醇;涡旋30 s,超声10 min,待净化。ProElut PLS固相萃取柱经6 mL甲醇、6 mL水活化后上样,采用5 mL纯水淋洗,弃去淋洗液,以6 mL甲醇洗脱,收集洗脱液。将洗脱液以氮气流吹干,准确移取1 mL乙醇溶解残渣,过0.22 μ m的有机滤膜后供仪器测定。

1.5 仪器方法的建立
1.5.1 液相色谱条件

色谱柱:Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18 (100 mm×2.1 mm,1.7 μ m);柱温:40 ℃;样品室温度:10 ℃;进样体积:5 μ L。流动相A为水,流动相B为乙腈。梯度洗脱程序:0～5.00 min,90%A降到40%A; 5.00～5.10 min,40%A降到5%A,并保持到7.50 min; 7.50～8.00 min,5%A降到0%A,并保持到8.50 min; 8.50～9.00 min,0%A升到90%A,并保持到10.0 min。流速:0.25 mL/min。

1.5.2 质谱条件

电喷雾离子源负离子(ESI-)模式电离;多反应监测(MRM)模式采集;毛细管电压:2.70 kV;锥孔电压:45 V;离子源温度:100 ℃;脱溶剂温度:400 ℃;脱溶剂气流量:600 L/h;碰撞室压力:0.33 Pa。其他质谱条件见表1。

表1 11种抗氧化剂的主要质谱条件参数 Table 1 Main parameters of the mass spectrometry of the 11 antioxidants
2 结果与讨论
2.1 仪器条件的优化

用流动注射的方式进行质谱条件的优化,确定了各待测化合物的毛细管电压、锥孔电压、离子源温度、脱溶剂温度等质谱参数,并对不同化合物的碰撞能量进行了优化,各物质的特征离子和碰撞能量如表1所示。部分化合物在正、负离子模式下均有一定的响应,但考虑到正、负离子模式间切换会对仪器的灵敏度造成一定的影响,且负离子模式下多数化合物均有极好的响应,因此本研究采用负离子模式。

对质谱检测器而言,不同的液相色谱流动相体系会影响目标化合物的离子化效率,从而影响其检测灵敏度。在负离子模式下,为增强目标化合物的离子化效率,通常在流动相中添加一定量的氨水或乙酸铵。采用甲醇-乙酸铵(2.0～10.0 mmol/L)溶液、乙腈-氨水(体积分数0～0.1% )溶液、乙腈-水溶液等为流动相进行预试验。结果发现甲醇体系中Irganox 1010出现严重拖尾；而乙腈-纯水体系的结果最佳。最终将流动相确定为乙腈-纯水溶液。

2.2 前处理条件的优化

11种抗氧化剂在水中的溶解性差别很大,部分化合物在纯水中的溶解度相对较小。配制了100 μ g/L 的标准溶液，其中乙醇的体积分数分别为0、10% 、20% 、30% 、40% 、50% 、60% 、70% 、100%，进行比较的结果见图1。体积分数50%以上的乙醇溶液才能将大部分目标化合物完全溶解;如取5 mL纯水为溶剂的标准溶液直接上柱,Irganox 1010、Nonflex CBP这两种化合物的回收率低于20% 。因此本研究选择水系模拟物中加入乙醇至体积分数为50% 。

图1 水系模拟物前处理中乙醇含量对分析物回收率的影响 Fig.1 Effect of ethanol content in pretreatment process of aqueous simulants on the recovery of the analytes

并且11种抗氧化剂在水系模拟物中的迁移量较低,需要通过固相萃取进行浓缩,置换为有机相体系后上机测定。固相萃取是目前理化分析中应用最为广泛的前处理技术之一，其具有溶剂置换与样品浓缩富集等优势,可缩短样品预处理过程,操作简单、省时、省力。参考文献［ 7],针对抗氧化剂多残留检测的需求，比较了ProElut PLS、Oasis HLB、C8、C18、NUXES、PLAEX等具有类似富集效果的固相萃取柱。取5 mL模拟液置于15 mL离心管中,加入乙醇至50%(v/v),涡旋30 s混匀,超声10 min后经上述固相萃取小柱净化。固相萃取小柱均经6 mL甲醇、6 mL水活化,直接上样,经5 mL水淋洗,6 mL甲醇洗脱。收集洗脱液于40 ℃下氮吹浓缩至干,加1 mL乙醇复溶,上机测定。如图2所示,使用ProElut PLS小柱能够保证绝大多数目标化合物的回收率;而使用Oasis HLB、C8、C18、NUXES、PLAEX时部分化合物回收率较低,可能由于50%乙醇中有机相比例较高,部分化合物未能与固相萃取填料结合而直接流出,导致回收率下降。根据回收率的结果选择ProElut PLS小柱进行前处理。

图2 固相萃取柱的选择(RSD≤20% , n=3) Fig.2 Selection of solid phase extraction column (RSD≤20% ,n=3)
2.3 精密度与准确度

采用液相色谱-串联质谱法进行样品测定,外标法定量时通常会出现基质增强或抑制效应,对检测结果造成影响。但本研究所选择的模拟物多为纯溶剂配制,样品基质较为干净,不会造成回收率与检测结果的较大偏差。因此,用乙醇配制了标准溶液,并分别以各化合物的峰面积(y)和对应的质量浓度(x,μ g/L)进行线性回归(见表2)。在线性范围内,各化合物的线性关系良好,相关系数均大于0.995;以信噪比(S/N)为3确定方法的检出限,以S/N为10确定方法的定量限,结果见表2。11种抗 氧化剂混合标准溶液(20 μ g/L)的二级质谱定量离子提取色谱图见图3。

表2 11种抗氧化剂的线性方程、线性范围、相关系数(r)、检出限和定量限 Table 2 Linear equations,linear ranges,correlation coefficients (r),LODs and LOQs of the 11 antioxidants

图3 11种抗氧化剂混合标准溶液(20 μ g/L) 的二级质谱定量离子提取色谱图 Fig.3 MS2 extracted ion chromatograms of quantification transition of the 11 antioxidants (20 μ g/L)

在5 mL体积分数为50%的乙醇水溶液中分别添加不同含量的混合标准溶液,按实验条件进行处理后测定,计算方法的加标回收率。11种抗氧化剂的加标回收率为61.4% ～109.4% ,RSD为3.9% ～18.2%(见表3)。结果表明方法准确可靠、重复性好、灵敏度高,且加标样品中目标物的特征子离子丰度比与标准品基本一致,满足质谱方法的确证要求。

表3 11种抗氧化剂的加标回收实验结果(n=6) Table 3 Results of the spiked recovery experiments of the 11 antioxidants (n=6)
2.4 实际样品的测定

对采集的12件塑料样品(保鲜袋5件、保鲜膜7件)进行浸泡,借鉴GB/T 23296.1-2009 中的极限浸泡方式(100 ℃下4 h)，并采用所建立的方法进行了检测,在11件塑料制品中检测到了Irganox 1010这种最常见的包装材料添加剂,含量为21.3～95.1 μ g/L 。对同一样品，10%(v/v)乙醇水溶液中测得的含量最高。由于该类化合物在纯水中的溶解度相对较小,在高浓度乙醇溶液中的溶解度较大,因此其在高浓度白酒中的迁移将更为严重。图4为一个阳性样品的二级质谱图。

图4 阳性样品的二级质谱离子提取色谱图 Fig.4 MS2 MS2 extracted ion chromatograms of a positive sample
3 结论

本文成功建立了水系模拟物中11种抗氧化剂的定性定量检测方法。实际样品检测结果说明,本方法准确可靠、灵敏度高,适用于水系模拟物中11种抗氧化剂的确证和定量检测,对评价抗氧化剂在食品中的迁移水平有较好的应用价值。

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