Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司),AB 4000Qtrap串联四极杆-线性离子阱质谱仪(ABSCIX,美国),QL-886涡旋混合器,DT5-2台式离心机,Millipore超纯水系统,Eppendorf移液器(100～1000 μ L和100～5000 μ L),JJ500型电子天平。甲醇、乙腈为农残级;甲酸、苯胺母体和苯胺同位素标准品均购自百灵威科技。0.22 μ m微孔滤膜分别购自天津津腾公司与美国安捷伦公司。

水样:取8.0 mL水样于15 mL聚丙烯离心管中,加入100 μ L质量浓度为2.500 mg/L 的同位素内标溶液,涡旋混合1 min,再加入2.00 mL乙腈,涡旋混合1 min,5000 r/min 离心5 min后取上清液过0.22 μ m滤膜待测。

鱼肉:称取经组织匀浆的鱼肉样品1.00 g于15 mL聚丙烯离心管中,加入100 μ L质量浓度为500 μ g/L 的同位素内标溶液,涡旋混合1 min,加入2.00 mL乙腈涡旋提取1 min,5000 r/min离心5 min后取上清液过0.22 μ m滤膜待测。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 苯胺的保留时间及优化的质谱条件 Table 1 Retention time and optimized MS-MS parameters for aniline Retention time/min Precursor ion (m/z) Product ion (m/z) Declustering potential/V Collision potential/V Q/q SD 2.25 94.1 77.1(Q) 100 30 3.88 0.09 51.1(q) 50 40 Q: quantitative ion; q: qualitative ion. Q/q: abundance ratios of Q and q.

表1 苯胺的保留时间及优化的质谱条件 Table 1 Retention time and optimized MS-MS parameters for aniline

鱼肉样品中苯胺的计算公式为C_x=C_i×V₁/m,水中苯胺的计算公式为C_x=C_i×(V₁+V₂)/V₂。其中C_x为鱼肉或水中苯胺的含量(ng/g或 μ g/L); C_i为由标准曲线计算得到的进样溶液中苯胺的质量浓度;V₁为乙腈的体积(mL); m为鱼肉样品的质量(g),V₂为水样的体积(mL)。

考察了甲醇与乙腈对鱼肉中苯胺的提取效率,结果表明,乙腈和甲醇对苯胺的平均提取效率分别为96.3%和87.4% ,两种溶剂均可满足残留分析的要求,乙腈的提取效率高于甲醇。考虑到流动相体系为乙腈水溶液,因此选用乙腈作为提取溶剂。试验还比较了超声萃取与涡旋萃取对鱼肉中苯胺的萃取效率。结果表明,超声萃取与涡旋萃取对苯胺的萃取效率分别为94.6%和92.5% ,两种方法对鱼肉中苯胺的萃取效率均较高,考虑到涡旋萃取更加简便,选择涡旋萃取。

比较了不同涡旋萃取时间对提取效率的影响(见图1),结果表明,萃取时间为1、2、3、4 min时,苯胺的回收率均在91% ～95%之间,4组结果相差无几,说明当萃取时间在1 min以上时,萃取率已达到较高水平,增加萃取时间并不能显著改善萃取效率,为节约分析时间,选定萃取时间为1 min。

图1

Fig. 1

图1 萃取时间对苯胺提取效率的影响 Fig.1 Effect of extraction time on the extraction efficiency of aniline

比较了250 μ L/min 和400 μ L/min 两种流速下的分离及响应情况。两种流速下,苯胺的色谱分离效果及色谱峰形均很好,响应也十分接近。但在较大流速下,峰形更加尖锐对称,可缩短分析时间三分之一以上,故选择流速为400 μ L/min。流动相的组成不仅可影响分离效果和色谱峰的形状,还影响灵敏度。流动相中加入甲酸等物质,可大大增强质谱检测信号,提高检测灵敏度,改善峰形。

在1.3节实验条件下,各类样品的色谱图见图2。实际样品的色谱峰峰宽较大可能是由共萃取组分的影响所致。

图2

Fig. 2

图 2 空白鱼肉样品、鱼肉添加样品(50 ng/g)、实际鱼肉 样品(60.8 ng/g)和苯胺标准样品(10 μ g/L)的总离子流色谱图 Fig.2 TIC chromatograms of blank fish,blank fish spiked with aniline (50 ng/g),fish sample from a polluted reservoir (60.8 ng/g) and aniline standard solution (10 μ g/L) Chromatographic conditions: SB-C18 column (100 mm×4.6 mm,1.8 μ m); mobile phases: acetonitrile-0.5%(v/v) formic acid aqueous solution (85 ∶ 15,v/v); flow-rate: 400 μ L/min; column temperature: 40 ℃; injection volume: 10 μ L.

采用保留时间与定性离子对来确认目标物。对不同浓度的苯胺标准溶液进行多次测定,确定保留时间为2.25 min。同时通过定量、定性离子对的丰度比(Q/q)来进行确认。Q/q理论值为21次试验的测定结果,即对7个不同质量浓度水平(0.5、2.5、5.0、25、50、250和500 μ g/L)的标准样品各测定3次的平均值。计算21次试验离子对的丰度比及标准差,见表1。苯胺的Q/q理论值为3.88,标准差为0.09,说明不管是低浓度还是高浓度,苯胺的Q/q值非常稳定。在苯胺的确认中,实际样品的Q/q值与理论值偏差不应超过20% ,如Q/q值的偏差超过20% ,可能存在干扰测定的情形,需采取措施进一步排除干扰。

试验过程中使用的某些器皿会对测定过程带来干扰,导致空白样品中检出较高含量的苯胺(见图3,Filter membrane-1)。分别用乙腈对前处理过程中使用的滤膜、离心管、针头过滤器等进行提取处理,测定提取后乙腈中的苯胺,考察空白干扰情况。结果发现某型号的针头过滤器造成空白干扰,因此在测定过程中需先对使用的过滤器、滤膜、离心管等前处理使用的器材进行空白确认。

图3

Fig. 3

图 3 不同材质滤膜用于空白溶剂测定的总离子色谱图 Fig.3 TIC chromatograms of solvent filtered with different filter membranes used for blank determination

为减小基质效应的影响,采用空白基质提取液作为溶剂配制标准曲线。在优化的色谱、质谱条件下,对0.5～500 μ g/L 的苯胺标准溶液进行3次测定,以分析物的质量浓度为X、分析物峰面积与内标物峰面积的比值为Y,计算得到苯胺的标准曲线方程。水中为y=0.301x+0.063(R²=0.9996),鱼肉中为y=0.306x+0.021(R²=0.9992),表明在0.5～500 μ g/L 范围内,苯胺在两种基质中均呈现出良好的线性关系。采用基质加标的方法来确定方法的检出限与定量限。在空白样品中分别添加苯胺标准溶液,得到0.25、0.50、1.00和5.00 μ g/L 的水添加样品及0.25、0.50、1.00和5.00 μ g/kg 的鱼肉添加样品,按照1. 2节方法处理后,以S/N≥3时的最低含量为检出限,S/N≥10时的最低含量为定量限。测得空白水和鱼肉中苯胺的检出限分别为0.50 μ g/L 和1.00 μ g/kg,定量限分别为1.00 μ g/L 和2.00 μ g/kg。

采用空白基质加标的方法评价准确度与精密度。以某水库水及市场采购的罗非鱼为基质,按前处理方法取样于聚丙烯离心管中,分别添加40、400 ng和5、50、100 ng的苯胺标准品,每个浓度水平做5个平行样品,按1.2节方法处理后上机测定,结果见表2。可以看出,该方法的准确度与精密度可满足痕量分析的要求。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表 2 苯胺在鱼肉和水中的添加回收率及RSD (n=5) Table 2 Recoveries and RSDs of aniline spiked in water and fish meat (n=5) Sample Spiked/ng Found/ng Recovery/% RSD/% Water 40 37.48 93.7 1.5 400 355.68 86.7 3.3 Fish 5 4.84 96.8 4.3 50 46.34 92.6 9.2 100 81.78 81.8 8.0

表 2 苯胺在鱼肉和水中的添加回收率及RSD (n=5) Table 2 Recoveries and RSDs of aniline spiked in water and fish meat (n=5)

利用上述建立的方法,对某受苯胺污染水域的水样及鱼中的苯胺含量进行了测定。13份水样中的9份检测到苯胺残留,含量分别为138.1、1943.6、11.1、16.0、5.3、1.2、10.4、2.6和5.6 μ g/L,最高浓度达 1943.6 μ g/L; 12份鱼样中的两份检出苯胺残留,含量分别为60.8和4.32 μ g/kg。