人工甜味剂(artificial sweeteners,ASs)是一类能赋予食品甜味且在人体内几乎不产生热量的人工合成或半合成的食品添加剂,主要用于食品加工业,还可用于制药、个人护理品、酿酒和饲料等行业[1, 2]。2010年,我国已成为亚太区最大的人工甜味剂生产国和消费国,市场规模大约为2.46万吨,总产量超过8万吨[3]。
自人工甜味剂被批准作为食品添加剂使用以来,已有大量毒理学方面的研究,但研究者对其安全性一直存在争议。一些人工甜味剂性质稳定,在污水处理厂和水环境中均难以降解[4, 5, 6, 7, 8, 9],加之极性较强,容易在水体中积累。有研究显示,4种典型人工甜味剂(三氯蔗糖、糖精、甜蜜素和安赛蜜)已在多个国家和地区的水体中检出,而且浓度高达 μ g/L水平[10, 11]。此外,Buerge等[12]研究表明,人工甜味剂可以通过污水灌溉、污泥施肥、粪肥返田等农业活动进入土壤。目前,有关人工甜味剂在土壤中的分布与行为研究尚不多见。土壤样品的成分复杂,干扰物较多,从而加大了分析测定难度,因此亟须针对这类痕量污染物建立一套高效、快速、灵敏的分析方法。文献[12]提及土壤中人工甜味剂的分析方法。该研究采用去离子水提取,在线固相萃取净化,液相色谱-串联质谱进行分析测定,但前处理方法耗时长、步骤复杂,对于有机质含量较高的土壤样品需先用有机溶剂浸泡,难以满足大批量环境样品分析测定的要求。
本文主要针对土壤中4种典型人工甜味剂(三氯蔗糖、糖精、甜蜜素和安赛蜜)的前处理方法进行了优化,结合本课题组已建立的HPLC-MS/MS检测方法[13],建立了一种快速简便、回收率高、精确可靠,能够满足土壤中人工甜味剂环境调查的分析方法。
Agilent 1200系列液相色谱-6410B三重四极杆质谱(美国Agilent Technologies公司);12管防交叉污染固相萃取装置(美国Supelco公司);HGC-12A型12位干式加热氮吹仪(上海楚定分析仪器有限公司);FD-1A-50冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司);TG 16-W型高速离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司);LDZM-60KCS立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)。
4种人工甜味剂三氯蔗糖、糖精、甜蜜素和安赛蜜标准品均购自美国Sigma-Aldrich公司,其基本信息见表1。3种氘代内标(三氯蔗糖-d6、糖精-d5、安赛蜜-d4)均购自加拿大Toronto Research Chemicals公司。离子对试剂Tris(三羟甲基氨基甲烷)购自美国Sigma-Aldrich公司;醋酸铵和醋酸钠均为色谱纯,购自德国CNW Technologies公司。甲醇、乙腈、丙酮、醋酸均为色谱纯;其他试剂均为分析纯。实验全过程采用去离子水。Poly-Sery PWAX固相萃取柱(3 mL/60 mg)和50 mL聚丙烯离心管均购自德国CNW Technologies公司。
标准曲线与定量:分别准确称取1.00 mg上述标准品,用去离子水溶解并定容至100 mL,配成10 mg/L 的混合标准储备液;经梯度稀释,配成系列浓度的标准工作溶液,并向其中加入20 μ g/L 的混合氘代内标溶液,以相对峰面积(A分析物/A内标物)为纵坐标、甜味剂质量浓度(C,μ g/L)为横坐标绘制标准曲线。其中三氯蔗糖-d6和糖精-d5分别用于三氯蔗糖和糖精的定量,安赛蜜-d4用于安赛蜜和甜蜜素的定量。
实验用土壤为天津潮土(pH 7.8),土壤中有机质含量为4.4%(质量分数)。将土壤风干,研磨,过0.2 mm孔径筛,在121 ℃下高压蒸汽灭菌30 min。在经上述处理的土壤中添加一定量的4种人工甜味剂混合标准溶液,用少量去离子水将其混匀，得到加标水平分别为1、10、100和 1 000 μ g/kg的土壤。同时,加入2%(m/m)叠氮化钠以抑制微生物生长。避光静置24 h,冷冻干燥,以备使用。
准确称取甜味剂添加水平为1 mg/kg(干重)的5 g土壤样品(过0.2 mm筛)若干份,分置于50 mL聚丙烯离心管中,分别加入25 mL不同的提取剂:甲醇、乙腈、丙酮、去离子水、醋酸钠溶液(0.001、0.01和0.1 mol/L)、0.01 mol/L 醋酸-醋酸钠溶液(pH 3、4、5和6),充分混合,振荡60 min,于 4 200 r/min 转速下离心10 min;取1 mL上清液,于 13 000 r/min 转速下离心10 min;取200 μ L上清液供HPLC-MS/MS测定。同时,设置空白组(采用未经污染的土壤样品,重复上述实验步骤)和后加标组(在高速离心前向提取液中加入1 mL 0.2 mg/L 混合标准溶液)以消除土壤背景浓度的干扰。每组3个平行样品。
准确称取5 g土壤样品(要求同1.3.1节),置于50 mL聚丙烯离心管中,加入25 mL 0.01 mol/L 醋酸-醋酸钠溶液(pH 4),充分混合,分别振荡20、40、60和120 min,其余处理同1.3.1节。
准确称取5 g土壤样品(要求同1.3.1节),置于50 mL聚丙烯离心管中,加入25 mL 0.01 mol/L 醋酸-醋酸钠溶液(pH 4),充分混合,振荡20 min,在 4 200 r/min 转速下离心10 min,移出上清液;再加入25 mL提取液,重复上述步骤,分别提取1、2、3和4次;合并上清液,其余处理同1.3.1节。
人工甜味剂在环境中以痕量水平存在,为了精确定量,需对样品进行净化并浓缩。本文对本课题组建立的水样中人工甜味剂的浓缩方法[13]加以改进,对提取液进行了净化与浓缩。将CNW Poly-Sery PWAX(3 mL/60 mg)固相萃取小柱先用6 mL甲醇冲洗活化,保持流速约为1 mL/min,再用6 mL 25 mmol/L 醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 4)冲洗,然后加入50 mL待处理的提取液,用6 mL 25 mmol/L 醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 4)洗去杂质,真空抽干5 min;再用6 mL含1 mmol/L Tris和5%(v/v)氨水的甲醇溶液(pH 11)洗脱。洗脱液置于40 ℃下氮吹近干,用甲醇定容至0.5 mL,供HPLC-MS/MS分析。
Agilent 1200系列液相色谱-6410B三重四极杆质谱仪;色谱柱:Athena C18-WP(150 mm×4.6 mm,3 μ m，德国CNW公司);柱温:30 ℃;流动相A:水(含1 mmol/L Tris和5 mmol/L 醋酸铵);流动相B:乙腈(含1 mmol/L Tris和5 mmol/L 醋酸铵)。梯度洗脱程序:0～8.0 min,0%B～75%B;8.0～9.0 min,75%B;9.0～10.0 min,75%B～10%B;10.0～10.5 min,10%B～70%B;10.5～12.4 min,70%B;12.4～12.9 min,70%B～0%B,并且在下一次进样测定前平衡8 min。流速:0.4 mL/min;进样量:20 μ L。离子源:电喷雾离子源;检测方式:负离子扫描多反应监测(MRM)模式;脱溶剂气(氮气)温度:350 ℃;脱溶剂气流速:10 L/min;喷雾气压:3.4 Pa;电离电压:4 kV。
方法回收率的计算公式:回收率=(A1-A0)/(A2-A0)×100% ,其中,A0为空白组测得的甜味剂的相对峰面积;A1为受污染土壤样品测得的甜味剂的相对峰面积;A2为后加标组测得的甜味剂的相对峰面积。
本文研究的人工甜味剂有别于传统的有机污染物,其具有较高的极性和亲水性。因此,本实验比较了传统的有机溶剂与去离子水分别作为提取剂时,土壤中4种人工甜味剂的回收率。由图1可知,3种有机溶剂对糖精和甜蜜素的提取效率(回收率)均低于50% ,而且甲醇和乙腈对三氯蔗糖的提取效率也不高;相比之下,去离子水对4种人工甜味剂均有较高的提取效率(回收率达到83.6% ～93.6% )。Buerge等[12]采用去离子水萃取土壤中上述4种人工甜味剂,回收率同本研究结果相近,多数土壤中目标物的回收率在80% ～120%之间。Soh等[14]同样用去离子水提取土壤中的三氯蔗糖,回收率为86% 。此外,对于食品中上述人工甜味剂的提取也常采用纯水或酸性水溶液[15, 16]。而对于糖精,也可使用氨水溶液作提取剂,其回收率可达95%[16]。可见,对于水溶性较强的人工甜味剂,水是一种高效、环境友好的提取剂。但将该提取方法与之后的固相萃取净化与浓缩相结合时,还需要解决两个问题:(1)本实验得到的提取液的pH为9.73,已超出固相萃取法pH的适用范围(pH 3～9); (2)对于有机质含量较高的土壤,在提取目标化合物的同时也提取出大量可溶性的有机质(呈淡黄色),这些物质容易被固相萃取小柱吸附,甚至堵塞小柱,不仅影响实验操作,而且增加了基质干扰。因此,要求选取的提取剂既能高效地萃取出目标化合物,又能减少基体干扰。对于有机质含量较高的土壤样品,Buerge等[12]采用甲醇浸泡的方法去除土壤中溶解性有机质的干扰,但该方法对土壤样品中溶解性有机质含量的高低未进行量化分析,不利于大批量环境样品的分析测定。本研究比较了采用4种含有一定离子强度的水溶液作提取剂对甜味剂的提取效果。结果发现,所考察的离子强度对目标甜味剂的回收率影响不大。采用0.01 mol/L 或0.1 mol/L 醋酸钠溶液作提取剂,不仅对三氯蔗糖、糖精、甜蜜素和安赛蜜均有较高的回收率(87.9% ～103.5% ),而且可以抑制有机质的析出。此外,实验进一步考察了不同酸度的提取液对土壤样品碱度的缓冲效果及对甜味剂的提取效率。经测定发现,采用pH 6的醋酸-醋酸钠溶液作提取剂时,其提取液pH值为9.6;而采用pH＜6的弱酸缓冲溶液作提取剂时,提取液pH为4.7～6.5,满足固相萃取对样品提取液pH值的要求。由于土壤颗粒的缓冲作用,pH对甜味剂的提取效率影响不显著。考虑到采用0.01 mol/L 醋酸-醋酸钠溶液(pH 4)作提取剂时,土壤中4种人工甜味剂均有较高的回收效率,因此选其为最佳的提取剂。
提取时间是指体系中加入提取剂后的振荡时间。一般来讲,提取时间与目标化合物的回收率之间存在一级动力学关系。随着提取时间的延长,回收率先增加然后趋于稳定。因此,最佳提取时间应既能保证较高的回收率,又能将较快地完成提取。本实验分别考察了不同的提取时间(20、40、60和120 min)对人工甜味剂回收率的影响。由图2a可知,三氯蔗糖的回收率随提取时间的延长基本上呈现出增高的趋势(除40 min时略有降低),分别为81.8% 、79.8% 、83.2%和84.9% ;糖精的回收率随提取时间的增加呈不稳定状态,分别为93.1% 、83.6% 、90.7%和82.8% ;甜蜜素的回收率较高,随提取时间的变化不大,为92.6% ～94.7% ;安赛蜜的回收率随提取时间的延长略有增加,分别为89.0% 、93.6% 、94.7%和94.7% 。4种人工甜味剂极性强、水溶解度高,可以较快地从固相分配到水相。用水溶液作提取剂时,在20 min内可提取出80%以上。基于减少前处理时间的考虑,选择20 min作为最优提取时间。
提取次数也是影响提取效率的一个重要因素。理论上,提取次数越多,对土壤中目标化合物的提取越完全,回收率越高。但随着提取次数的增加,提取出的土壤基质也会有所增加,进而影响分析测定。本实验考察了不同提取次数下人工甜味剂的回收率,实验结果如图2b所示。总体上,三氯蔗糖、糖精、甜蜜素和安赛蜜的回收率随提取次数的增加而增大,尤其是经过2次提取后,回收率明显高于仅提取1次的回收率,分别为90.3% 、99.9% 、99.0%和98.1% 。与2次提取的回收率相比,经过3次和4次提取的甜味剂回收率增加趋势并不明显,但却增加了实验操作的复杂性。考虑到土壤样品经过2次提取后甜味剂的回收率已可满足分析要求,故选择最佳提取次数为2次。
由上可知,最优的提取方法为:采用25 mL 0.01 mol/L 醋酸-醋酸钠溶液(pH 4)对土壤样品进行提取,提取2次,每次振荡20 min。
由于土壤样品采用水溶液作提取剂,因此提取液可以参考本课题组已建立的水样中人工甜味剂的提取方法进行浓缩和净化[13]。实验通过分析测定干燥土壤中添加不同水平(1、10、100 μ g/kg)目标物的回收率、日内精密度、日间精密度、线性相关系数、检出限和定量限,对分析方法的可靠性进行评估(见表2)。由实验结果可知,该方法在4种人工甜味剂的加标水平为1、10和100 μ g/kg(干重)时,回收率较高,平均回收率范围在86.5% ～105%之间,日内精密度≤5.94% ,连续3天重复本实验得到的日间精密度≤6.53% 。而且这些甜味剂在1～100 μ g/kg(干重)范围内呈现良好的线性关系,相关系数(r2)均在0.995以上。以信噪比为3和信噪比为10对应的浓度确定为方法的检出限和定量限,分别为0.01～0.21 μ g/kg 和0.03～0.70 μ g/kg。
采用本文建立的分析方法对天津市某污水灌溉的农田土中4种人工甜味剂含量进行了测定(见图3)。提取前在土壤样品中加入10 μ L 1 mg/L 混合氘代内标溶液,用于校正基质效应和回收率,实验结果如表3所示。3份土壤样品中均检出了糖精、甜蜜素和安赛蜜,最高含量可达11.8 μ g/kg(干重);其中有2个土壤样品中还检测出三氯蔗糖。调查发现该农田灌溉水体常年接收附近污水处理厂的出水。本课题组[9]也在该出水中检出上述4种人工甜味剂,而且研究表明这些人工甜味剂在污水处理厂中降解不彻底甚至难以降解,因此上述人工甜味剂很有可能是通过污水灌溉进入农田土壤。
本研究在着重优化土壤中人工甜味剂的前处理方法基础上,提出了水溶液萃取-固相萃取浓缩与净化-HPLC-MS/MS分析,内标法定量的分析方法,并评估了分析方法的回收率和可靠性。该方法快捷可靠,可直接用于分析有机质含量较高的土壤样品,并已成功应用于天津市某污水灌溉农田土壤的检测,为土壤环境中人工甜味剂的考察提供了可靠的分析测定方法。由于一些人工甜味剂在水环境中广泛存在而且难以降解,容易通过受污水体进入土壤,因此,人工甜味剂在土壤环境中的分布和迁移转化规律应引起重视。
2014, Vol. 32 Issue (9): 930-935
PDF (1068 KB)
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